СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ АССОЦИИРОВАННОЙ ПРОТИВ СТРЕПТОКОККОЗА И ВИРУСНОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ КРОЛИКОВ Российский патент 2011 года по МПК A61K39/09 A61K39/12 A61P31/00 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способу изготовления ассоциированной вакцины против стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, и может быть использовано в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся разработкой и конструированием вакцинных препаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известен способ получения поливалентной вакцины против кишечных инфекций (патент РФ на изобретение №2080875 от 18.03.92, МКИ A61K 39/125, 39/135). Данный способ получения поливалентной вакцины включает раздельное выращивание культур Salmonella typhi, Salmonella paratyphi В, Shigella Flexneria, Shigella Sonne, отделение биомассы от питательной среды, экстракцию антигенов проводят водно-солевым раствором при шуттелировании в присутствии антибиотика и мелкораздробленного стекла в течение 1-1,5 ч, полученные экстракты центрифугируют, очистке подвергают супернатанты и после смешивания получают целевой продукт в виде смеси клеточных стенок, содержащих О-антигены используемых культур, со жгутиками, содержащими Н-антигены, и растворимыми Vi-антигенами сальмонелл. Технология получения данной вакцины очень сложная и для профилактики инфекционных болезней кроликов не рекомендуется.

Известен способ получения вакцины против стрептококкоза и пастереллеза нутрий (патент РФ на изобретение №2099083 от 30.09.94, МКИ A61K 39/125, 39/135). Данный способ предусматривает раздельное выращивание в жидкой питательной среде с добавлением глюкозы штаммов Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ №К-ДЕП, Pasteurella multocida ВГНКИ №2394 и Pasteurella multocida ВГНКИ №1015 в течение 18-24 часов, полученные культуральные среды подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкие фракции, инактивируют 0,3-0,4%-ным раствором формалина, объединяют их в равных соотношениях по объему и последовательно вносят гидроокись алюминия. Данный способ позволяет получать вакцину против стрептококкоза и пастереллеза нутрий. Технология получения данной вакцины сложная, после введения животным вызывает поствакцинальные осложнения (воспаление, абсцессы, хромоту).

Известен способ изготовления бивалентной вакцины против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов (патент РФ на изобретение №2064304 от 27.07.96, МКИ A61K 39/275). Данный способ предусматривает раздельное выращивание вакцинного вируса миксоматоза кроликов в культуре клеток куриных фибробластов с активностью не 10^4,0 ИД 50/см³ замораживают-оттаивают, смешивают с инактивированной суспензией печени кроликов, зараженной вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов, в соотношении 1:1, стабилизируют полученную смесь защитной средой при соотношении 10:1, фасуют и лиофилизируют после замораживания при минус 55±5°С в течение 10±2 ч путем выдерживания материала при температуре от минус 50±5°С до 0°С в течение 31±1 ч и затем от 0°С до плюс 20±1°С и досушивают в течение 3±1 ч.

Техническим решением задачи изобретения является устранение перечисленных недостатков, в частности повышение специфичности, эффективности способа изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, путем введения новых возбудителей, компонентов, исключая отрицательное и побочное влияние.

Поставленная задача достигается тем, что способ изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, включающий получение антигенов, инактивацию, внесение адъюванта, отличается тем, что проводят отбор пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, раздельно выращивают культуры Streptococcus pneumoniae в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, приготавливают 10-15%-ную суспензию печени кроликов, павших от заражения вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов, раздельно инактивируют путем внесения формалина до 0,1-0,4%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в отличие от известных способов проводят отбор пораженных органов от павших кроликов в период заболевания, гибели их от стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, приготавливают суспензию, выделают чистые культуры возбудителей посевом на дифференциально-диагностические среды. Используют при раздельном выращивании чистой культуры Streptococcus pneumoniae в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2% и получают концентрацию микробных клеток не менее 4-5 млрд в 1 см³. Для получения специфичного вирусного сырья кроликов заражают вирусом геморрагической болезни кроликов, выделенным из местного эпизоотического очага, проводят экстрагирование вируса из 10-15%-ной суспензии печени павших кроликов при температуре 4-6°С в течение 10-12 часов при периодическом перемешивании и освобождение от клеточного детрита фильтрованием через два слоя марли, что позволяет увеличить выход вирусного сырья в два-три раза. Инактивируют культуры возбудителей раздельно формалином до 0,1-0,4%-ной конечной концентрации при температуре 37°С в течение 72-96 часов и смешивают инактивированные культуры в равных соотношениях, что позволяет полностью подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность против стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Добавление гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему культуры позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ кроликов обеспечить у привитых формирование напряженного иммунитета против двух инфекционных болезней. Способ обеспечивает получение безвредной, высокоиммуногенной, специфичной вакцины для защиты кроликов от стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Что касается критерия «промышленная применимость», то компоненты, входящие в состав вакцины, известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин: ассоциированная вакцина против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов (СТО 00495549-0044-2007); ассоциированная вакцина против пастереллеза и вирусной геморрагической болезни кроликов (ТУ утверждены 30.09.94 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины утверждена 27.05.94 г.); ассоциированная вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции поросят, ТУ 10.09-62-90, утверждено 01.08.90 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины утверждена Главным управлением ветеринарии 16.07.90 г.; вакцина против энтерококковой инфекции телят, ягнят и поросят, ТУ 10.09-91-90, утверждено 15.12.90 г.; вакцина против геморрагической болезни кроликов тканевая инактивированная гидроокисьалюминиевая СТО 00495549-0005-2006.

Методы выделения и характеристика стрептококков представлены в «Методических указаниях по лабораторной диагностике стрептококкоза животных», утвержденных 25.09.1990 г. Главным управлением ветеринарии с государственной инспекцией при Государственной комиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам, а также в справочнике «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» под редакцией профессора Сидорова М.А., Москва. - Колос, 1995, стр.90-95.

Методы выделения и характеристика вирусной геморрагической болезни кроликов описаны в «Методических указаниях по лабораторной диагностике вирусной геморрагической болезни кроликов», утвержденных ГУВ Госагропрома СССР 28.12.88.г; в книге «Вирусная геморрагическая болезнь кроликов», авторы: Шевченко А.А., Вишняков И.Ф., Бакулов И.А., Власова Т.А. М.: «Две Короны», 1995, 48 с.; в книге «Болезни кроликов», авторы: Шевченко А.А., Шевченко Л.В., Литвинов A.M. М.: «Аквариум», 2002, стр.42-57.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что проводят отбор пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей инфекционных болезней стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, раздельно выращивают чистую культуру возбудителя Streptococcus pneumoniae в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, а вирусом геморрагической болезни кроликов заражают кроликов, которые погибают через 48-72 ч. Затем приготавливают 10-15%-ную суспензию из печени павших кроликов от зараженных вирусом геморрагической болезни кроликов, инактивируют раздельно путем внесения формалина до 0,1-0,4%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 48-96 часов, смешивают инактивированные культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины

Для изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов проводят отбор пораженных органов от павших кроликов в период заболевания их стрептококкозом и вирусной геморрагической болезнью, из которых приготавливают суспензию, и проводят лабораторные исследования с целью выделения чистых культур возбудителей.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя стрептококкоза готовят мазки - отпечатки из пораженных органов павших нутрий, путем прикосновения обезжиренным стеклом к свежему разрезу пораженной ткани и последующей фиксацией над пламенем спиртовки окрашивают их по методу Грама. При микроскопии препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают мелкие кокки в виде цепочек, окрашенные в фиолетовый цвет, характерные для рода Streptococcus. Для определения культуральных свойств возбудителя делают посевы выделенной культуры из патматериала в мясо-пептонный бульон с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 10% инактивированной сыворотки лошади (МПБ) в чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА) с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 5% дефибринированной крови кролика. Через 18-20 часов инкубирования в термостате при температуре 37°С наблюдают в МПБ рост в виде диффузного помутнения среды. В чашках Петри с кровяным МПА наблюдают рост мелких росинчатых, слегка мутноватых с ровными краями колоний, окруженных зеленоватой зоной гемолиза, что характерно для Streptococcus pneumoniae.

Для дифференциации стрептококков от стафилококков используют каталазную пробу. При постановке каталазной пробы на предметное стекло наносят каплю свежеприготовленного 3%-ного раствора перекиси водорода. Бактериологической петлей снимают одну колонию исследуемой культуры и растирают ее в капле перекиси водорода. Стафилококки в отличие от стрептококков образуют каталазу и вызывают пенообразование. Для предварительной идентификации стрептококков и энтерококков баккультуру высевают в пробирки с 10%, 40% желчи, с 6,5% хлористого натрия, с углеводами (раффинозой, сорбитом, маннитом), учитывают рост в жидкой среде и гемолиз на МПА с кровью.

В результате в пробирках с желчью наблюдают диффузный рост баккультуры, отмечают ферментацию маннита. На МПА с кровью наблюдают неполный гемолиз эритроцитов с образованием вокруг колоний зеленоватой зоны, что характерно для стрептококков группы D.

Для установления серогрупповой принадлежности стрептококков используют стрептококковые групповые преципитирующие сыворотки. Серогрупповую принадлежность стрептококков определяют в реакции преципитации (РП) в капиллярах. Патогенность подтверждают биопробой на молодых белых мышках.

Выращивание чистой культуры возбудителя проводят в мясо-пептонном бульоне. Для заражения берут 1-2 см³ культуру Streptococcus pneumoniae, засевают 80-100 мл жидкой питательной среды и выращивают при 37°С в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 4-5 млрд в 1 см³.

Для получения вирусного сырья при изготовлении вакцины используют не привитых против вирусной геморрагической болезни кроликов массой не менее 1,5 кг, заражают их вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов, выделенным из эпизоотического очага с инфекционной активностью 10³ ЛД₅₀/мл. Через 48-72 часа кролики погибают, от павших берут печень в целлофановые пакеты, замораживают, измельчают ножницами и на гомогенизаторе. Полученное сырье доводят физраствором (pH 7,2) до 10-15%-ной суспензии, затем экстрагируют вирус при температуре 4-6°С в течение 10-12 часов, периодически перемешивая, декантируют надосадочную жидкость, к осадку добавляют физраствор 1:1, перемешивают. Для освобождения от клеточного детрита проводили фильтрование через два слоя стерильной марли. Затем отфильтрованное вирусное сырье, баксырье сливают в емкость и проводят инактивацию внесением формалина 0,1-0,4%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 48-96 часов при периодическом перемешивании, затем смешивают инактивированные антигены в равных соотношениях, вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему и тщательно перемешивают, фасуют и укупоривают.

Таким образом, использование для изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов чистых культур возбудителей Streptococcus pneumoniae и вирусной геморрагической болезни кроликов, выделенных из местного эпизоотического очага, позволяет получать специфичную, высокоиммуногенную ассоциированную вакцину для защиты от этих двух опасных инфекционных болезней стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Раздельное выращивание возбудителей позволяет получать концентрацию Streptococcus pneumoniae не менее 4 млрд в 1 см³ в течение 12-14 часов инкубирования и вируса геморрагической болезни кроликов с инфекционной активностью 10³ ЛД₅₀/мл. Использование формалина для инактивации в 0,1-0,4%-ной конечной концентрации позволяет в течение 48-96 часов при температуре 37°С подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения. Адсорбирование двух антигенов на гидроокиси алюминия позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ обеспечить у привитых кроликов формирование напряженного иммунитета против стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов продолжительностью не менее 9 месяцев (срок наблюдения). После однократного введения кроликам внутримышечно не вызывает у них поствакцинальных осложнений.

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Изобретение относится к ветеринарной медицине и биологической промышленности. Способ изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов заключается в том, что проводят отбор пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, раздельно выращивают культуру Streptococcus pneumoniae в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³ и получением 10-15%-ной суспензии печени от кроликов после заражения вирусной геморрагической болезнью кроликов с активностью не менее 10^3,0 ЛД 50/см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,1-0,4%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 48-96 часов, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают. Изобретение обеспечивает повышение продолжительности сохранения поствакцинального иммунитета и срока хранения вакцины. 1 табл.

Способ изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, включающий получение антигенов, инактивацию, внесение адъюванта, отличающийся тем, что проводят отбор пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, раздельно выращивают культуру Streptococcus pneumoniae в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³ и получением 10-15%-ной суспензии печени от кроликов, после заражения вирусной геморрагической болезнью кроликов с активностью не менее 10^3,0 ЛД 50/см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,1-0,4%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 48-96 ч, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.