СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ПРОТЕАЗ Советский патент 1973 года по МПК C12N9/99 C07G3/00 

1

Известен снособ получения ингибитора протеаз путем автолиза измельченного животного сырья, отделения жмыха, экстрагирования, подщелачивания, обработки экстракта сульфатом аммония, нагревания, подщелачивания раствора, фильтрации, высушиваиия.

Однако известный способ не обеспечивает получения ингибитора протеаз в едином технологическом цикле с гепарином и пептоном и, кроме того, ингибитор протеаз недостаточно активен.

Для повышения активности ингибитора протеаз с одновременным получением гепарина и пептона из белковых отходов после извлечения ингибитора экстракт после автолиза обрабатывают водой и перед нагреванием осадок обрабатывают 0,65 н. раствором соляной кислоты, жмых обрабатывают хлористым натрием с последующей обработкой осадка ацетатом калия, далее осадок после извлечения гепарина охлаждают, обрабатывают водой и известным способом выделяют пептон.

Пример. 10 кг замороженных легких крупного рогатого скота измельчают на куттере и выдерживают при комнатной температуре в течение 17 час. Затем добавляют 3 объема воды, охлажденной до 8-12° и перемешивают в течение 2 час.

Легочную ткань (жмых) отделяют центрифугированием, промывают небольшим количеством (около 0,5 объема) воды при рН 7,0 и используют для выделения гепарина.

Выделение ингибитора протеаз.

Экстракт и промывные воды объединяют и добавлением 5 н. раствора едкого натра устанавливают рН 7,0 и высаливают балластные белки сульфатом аммония из расчета 113 г/л. Осадок отделяют фильтрованием через сукно

бета и выбрасывают, а из фильтрата высаливают ингибитор-сырец сульфатом аммония из расчета 510 г/л. После отстаивания в течение 10-12 час при температуре 5°С надосадочную жидкость сифонируют, а осадок отделяют

фильтрованием на нутч-фильтре. Затем осадок, содержащий ингибитор протеаз, растворяют в 3,5 объемах 0,65 н. раствора соляной кислоты, прогревают при 80°С в течение 4 мин, после чего быстро охлаждают до комнатной

температуры и центрифугируют. Белковый осадок промывают 2 объемами воды. Промывные воды объединяют с основным раствором и добавлением 5 н. раствора едкого натра устанавливают рН 7,5. Ингибитор протеаз высалнвают сульфатом аммония из расчета 600 г/л, отделяют фильтрованием на воронке Бюхнера, растворяют в 10 объемах воды, обессоливают методом диализа и лиофилизируют. Выход ингибитора протеаз активностью 650-

700 ЕД. из 1 кг легких составляет 320 мгЖмых после извлечения ингибитора трипсина и промывания экстрагируют 1,5 объемами 0,7 мол. раствора хлористого иатра при рН 9-9,5 и температуре 55-60° в течение 1,5 час. Затем температуру смеси поднимают до 100°С для коагуляции балластных белков, охлаждают до 35-40°С и фильтруют. Осадок используют для получения пептона. В полученном фильтрате добавлением 17%-ного раствора соляной кислоты устанавливают рН 2,5. Выпавший солянокислый осадок гепарина-сырца отделяют центрифугированием и суспендируют в 4 объемах 15%-ного раствора хлористого натра. К суспенвии прибавляют 20%-ный раствор хлористого кальция пр рН 9-9,5 и температуре 70-75°С, смесь нагревают до 95°С, скоагулированный балласт отделяют фильтрованием, а раствор охлаждают до 30-35°С и подкисляют соляной кислотой до рН 2,5. Выпавший осадок отделяют центрифугированием. В растворе устанавливают рН 8,2-8,3 добавлением 5 п. раствора едкого натра и осаждают гепарин 1,5 объемами этилового спирта.

Через 12-15 час надосадочиую жидкость удаляют сифонированием, а осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 объемах воды при рН 9-9,5 и температуре 60- 70°С. После этого добавляют к объему смеси 30%-ный раствор перекиси водорода для обесцвечивания, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют. К прозрачному фильтрату добавляют до двух молей ацетата калия и уксусной кислоты до рН 5,5, нагревают до 55- 60°С и быстро охлаждают до 5-8°С, после чего выдерживают при этой температуре в течение 10-12 час. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 объемах воды, обрабатывают ионообменной смолой КУ-2 в Н-форме в статических условиях и после отделения смолы из раствора осаждают гепарин при рН 6,0-6,5 (устанавливают добавлением едкого натра) равным объемом спирта. Выход: 1 кг легких - 11700 ед. с активностью 96 ед/мг.

Получение пептона.

Остатки легочной ткани после извлечения гепарина быстро охлаждают до 15-18°С водой, снижая рН до 6,0-6,5. Остаток суспендируют с двумя объемами воды и нагревают до 40°С. В нагретую смесь добавляют фосфорную кислоту с таким расчетом, чтобы начальное рН смеси было 1,7-1,8. В смесь добавляют 8% слизистой оболочки свиных желудков и выдерживают при 45°С в течение 18-23 час до полного переваривания ткани. После окончания гидролиза прозрачную жидкость кипятят с добавлением гидроокиси кальция, устанавливают в растворе рН 8,2-8,5. Горячий раствор отделяют от осадка и при 50°С добавляют 1 % поджелудочной железы убойных животных.

Трипсиновый гидролиз проводят при 50°С, рН 8,2-8,5 до полного переваривания белка, что определяется по качественной реакции на белок в присутствии 20%-пой трихлоруксусной кислоты.

По окончании протеолиза лизат доводят до кипения, затем добавлением фосфорной кислоты устанавливают рН 6,0-7,0 и фильтруют в горячем состоянии через сукно бета.

Прозрачный раствор высушивают известными методами, например на распылительной сушилке.

Выход пептона - 50 г из 1 кг легких.

Предмет изобретения

Способ получения ингибитора протеаз путем автолиза измельченного животного сырья, отделения жмыха, экстрагирования, подшелачиваиия, обработки экстракта сульфатом аммония, нагревания, подшелачивания раствора, фильтрации, высушивания, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта с одновременным получением гепарина и пептона, после автолиза экстракт обрабатывают водой и перед нагреванием осадок обрабатывают 0,65 в. раствором соляной кислоты, жмых обрабатывают хлористым натрием с

последующей обработкой осадка ацетатом калия, далее осадок после извлечения гепарина охлаждают, обрабатывают водой и известным способом выделяют пептон.