СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОСНОВНОГО ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНАЗ Российский патент 2002 года по МПК A61K38/55 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения основного ингибитора протеиназ (ОИП) из органов крупного рогатого скота (КРС), и может быть использовано в медицинской промышленности для приготовления лекарственных препаратов, используемых для лечения заболеваний, связанных с нарушением системы протеолиза.

Возникновение неконтролируемого протеолиза является одной из причин серьезных заболеваний, поэтому продолжаются активные работы по получению и исследованию новых белков-ингибиторов, которые можно использовать в заместительной терапии при лечении заболеваний, сопровождающихся избыточной активацией протеолитических систем организма (воспалительные процессы, острый панкреатит, злокачественные новообразования и др.). В связи с этим актуальной задачей является разработка новых способов выделения ингибиторов протеиназ.

Известен способ получения основного ингибитора протеиназ (типа Кунитца) из органов КРС (Патент Германии N 1492114, кл. А 61 К 17/00, 1972), заключающийся в следующем: легкие или поджелудочную железу КРС измельчают, экстрагируют 1%-ным раствором щавелевой кислоты, удаляют осадок фильтрованием, проводят хроматографию на селикагеле, целевой продукт элюируют ацетоном с последующим его подщелачиванием, ОИП осаждают 4-6 объемами ацетона, обессоливают и высушивают. Выход ОИП составляет 40000-57000 Е/кг с удельной активностью 500-600 КИЕ/мг.

Недостатками известного способа являются низкая экологичность способа (используются большие количества ацетона) и недостаточный выход и чистота целевого продукта.

Известен способ плучения ингибитора протеиназ из околоушных слюнных желез КРС (АС СССР 1823184, кл. А 61 К 35/37, 1996), заключающийся в следующем: свежезамороженные железы гомогенизируют, гомогенат заливают раствором уксусной кислоты при соотношении ткань-кислота 1:8-1:10 с добавлением хлористого цинка в количестве 1 г на 1 литр смеси при рН 3-3,5. Экстракцию проводят при температуре +4-8^oС в течение 36-60 часов, экстракт фильтруют, фильтрат обрабатывают ацетоном в соотношении 1:5 при температуре -5-+5^oС и формируют осадок в течение 18-22 часов. Полученный осадок, содержащий целевой продукт, растворяют в дистиллированной воде, фильтруют через цеолитовый фильтр, а фильтрат лиофилизируют. Полученный ингибитор протеиназ представляет собой комплекс полипептидов с мол.массой 2000-10000 Да.

Недостатками известного способа являются сложность и многостадийность процесса, использование легковоспламеняющегося, токсичного вещества (ацетон) и недостаточная чистота целевого продукта.

Известен способ получения ОИП из органов КРС (Патент РФ N 2067868, кл. А 61 К 38/55, 1996), заключающийся в следующем: легкие, поджелудочную железу или слюнные железы КРС измельчают, проводят экстракцию в растворе фосфорной кислоты, отделяют жмых, обрабатывают экстракт для удаления липидов и белков, ОИП хроматографируют на катионите, из элюата с ионита после обработки соляной кислотой до рН 1-3 удаляют балластные белки, супернатант обрабатывают трихлоруксусной кислотой до ее концентрации 2,5-7,0%, удаляют примесные белки, высаливают ОИП хлоридом натрия до его конечной концентрации 320 г/л, отделяют высокомолекулярные белки и пигменты хроматографией, а затем выделяют конечный продукт осаждением ацетоном или лиофильной сушкой. В результате получают ОИП с выходом 10 мг/кг сырья и с активностью 5000 КИЕ/мг.

Недостатками известного способа являются многостадийность, сложность и длительность процесса, использование спирта и ацетона, недостаточный выход целевого продукта.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом является способ получения ОИП из органов КРС (Патент РФ N 2088241, кл. А 61 К 38/55, 1997), заключающийся в следующем: замороженные легкие, поджелудочную или слюнные железы измельчают, гомогенизируют, в гомогенат добавляют воду в соотношении сырье-вода 1:3 и ТХУ или уксусную кислоту до рН 1-3, гомогенат размешивают и проводят экстракцию в течение 1 часа при комнатной температуре. Экстракт отделяют от осадка (жмыха) центрифугированием. Доводят рН супернатанта до 6,2-7,2 (с помощью NaOH) и подвергают последний ультрафильтрации на полых волокнах сначала с размером пор 15-50 кДа, а затем с размером пор 5 кДа. Полученный концентрат наносят на колонку с карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенную водой, и проводят сорбцию целевого продукта при рН 6,2-7,2, а десорбцию 0,45 М раствором хлорида натрия. В результате выход целевого продукта из поджелудочной железы составил 104500 Е/кг с удельной активностью 5500 КИЕ/мг, а из легких - 455000 Е/кг с удельной активностью 6500 КИЕ/мг.

Недостатком известного способа является недостаточный выход и чистота ОИП, не соответствующая требованиям, предъявляемым к медицинским препаратам ингибитора протеиназ, препятствующая его использованию как лекарственной формы.

Технической задачей изобретения является повышение выхода и чистоты целевого продукта.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем: замороженное сырье, преимущественно легкие КРС, измельчают в мясорубке и гомогенизируют. Гомогенат заливают водным раствором соляной кислоты при соотношении сырье-кислота 1:2-3 с добавлением хлористого натрия в количестве 15-16 г на 1 л смеси при рН 1,9-2,1, перемешивают и проводят экстракцию при комнатной температуре в течение 10-12 часов. Экстракт отделяют от осадка центрифугированием, а полученный супернатант подвергают ультрафильтрации на полых волокнах с размером пор 50 кДа. Получают две фракции: фильтрат, содержащий основное количество целевого продукта и примесные белки с мол. массой меньше 50 кДа, концентрат, содержащий высокомолекулярные белки с мол. массой более 50 кДа и некоторое количество целевого продукта. Фильтрат направляют на концентрирование ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 5 кДа, а концентрат подвергают тепловой обработке для удаления липидов и балластных белков. Для этого доводят рН концентрата до 4,8-5,2 с помощью 0,5 М раствора NaOH и нагревают до 75-77^oС с последующим его охлаждением до 20^oС. Выпавший осадок примесных белков удаляют центрифугированием, а полученный центрифугат объединяют с концентратом, прошедшим ультрафильтрацию на полых волокнах с размером пор 5 кДа. Объединенные две фракции наносят на колонку с карбоксиметилцеллюлозой СМ-32, проводя сорбцию целевого продукта при рН 4,8-5,2, а десорбцию 0,5 М раствором хлорида натрия при том же рН.

Получают апирогенный препарат с выходом 600000-640000 Е/кг с удельной активностью 8500 КИЕ/мг. По данным электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле (рН 4,5) препарат гомогенен по белковому составу и не содержит примесных белков. Дополнительная оценка качества продукта с помощью аминокислотного анализатора и высокоэффективной жидкостной хроматографии показала его идентичность основному ингибитору протеиназ Кунитца.

Отличительными признаками заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:
1. Экстракцию целевого продукта проводят водным раствором соляной кислоты при рН 1,9-2,1 в течение 10-12 часов, что позволяет повысить выход целевого продукта.

Использование в качестве экстрагента соляной кислоты позволяет повысить экологичность процесса. Наилучшие результаты экстракции наблюдаются при рН 1,9-2,1, так как более высокие значения рН приводят к недостаточному выходу белка, а при более низких значениях рН усиливается гидролиз белков. Оптимальная экстракция белков с мол.массой 6-7 кДа происходит в течение 10-12 часов, так как уменьшение времени экстракции приводит к снижению выхода целевого продукта, а увеличение - к гидролизу белков.

2. Экстракцию осуществляют в присутствии хлорида натрия в количестве 15-16 г на 1 л смеси, что обеспечивает более полный выход целевого продукта в экстрагирующий раствор.

3. После концентрирования экстракта на полых волокнах с размером пор 50 кДа фильтрат направляют на ультрафильтрацию на полых волокнах с размером пор 5 кДа, а оставшийся концентрат не отбрасывают, а подвергают очистке, для чего предварительно устанавливают рН раствора 4,8-5,2, а затем нагревают до 75-77^oС с последующим охлаждением до 20^oС, что позволяет сконцентрировать фильтрат в 20 раз и избавиться от низкомолекулярных примесей для последующего извлечения из него целевого продукта и провести очистку концентрата от липидов и примесных белков для дополнительного извлечения целевого продукта. При этом полученные две фракции объединяют и направляют на хроматографическую очистку целевого продукта. В прототипе концентрат после ультрафильтрации на полых волокнах с размером пор 50 кДа просто выбрасывают, теряя часть целевого продукта.

Именно вышеназванные отличительные признаки заявляемого способа, вкупе с известными, позволяют получить качественно новый положительный эффект, а именно повысить выход и чистоту целевого продукта.

Поиск по источникам научно-технической и патентной литературы не выявил известного способа, аналогичного заявляемому, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям изобретения "новизна и изобретательский уровень".

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Один кг замороженных легких КРС измельчают в мясорубке, затем гомогенизируют, заливают гомогенат 2 объемами воды (2000 мл) и добавляют 30 г хлорида натрия с последующим постепенным вливанием 25%-ного раствора соляной кислоты до рН 1,9. Экстракцию проводят в течение 10 часов при комнатной температуре. По окончании экстракции жмых удаляют центрифугированием, а полученный супернатант подвергают ультрафильтрации на полых волокнах с размером пор 50 кДа. Далее фильтрат в количестве 1500 мл направляют на концентрирование на полых волокнах с размером пор 5 кДа, а 150 мл оставшегося концентрата доводят с помощью 0,5 М раствора NaOH до рН 4,8 и нагревают до 75^oС с последующим охлаждением до 20^oС. Выпавший осадок отделяют центрифугированием. Центрифугат (150 мл) объединяют с концентратом (75 мл), прошедшим ультрафильтрацию на полых волокнах с размером пор 5 кДа, и наносят смесь на колонку с карбоксиметилцеллюлозой фирмы "Ватман", уравновешенную водой. Сорбцию ОИП осуществляют при рН 4,8, а десорбцию - 0,5 М раствором хлорида натрия при том же рН. Полученный элюат обессоливают диафильтрацией, подвергают стерилизующей фильтрации и лиофильной сушке.

Выход ОИП составил 600000 Е/кг с активностью 8000 КИЕ/мг.

Пример 2.

Один кг замороженных легких КРС измельчают в мясорубке, затем гомогенизируют, заливают гомогенат 3 объемами воды (3000 мл) и добавляют 32 г хлорида натрия с последующим постепенным вливанием 25%-ного раствора соляной кислоты до рН 2,1. Экстракцию проводят в течение 12 часов при комнатной температуре. По окончании экстракции жмых удаляют центрифугированием, а полученный супернатант подвергают ультрафильтрации на полых волокнах с размером пор 50 кДа. Далее фильтрат направляют на концентрирование на полых волокнах с размером пор 5 кДа, а оставшийся концентрат доводят с помощью 0,5 М раствора NaOH до рН 5,2 и нагревают до 77^oС с последующим охлаждением до 20^oС. Выпавший осадок отделяют центрифугированием. Центрифугат (150 мл) объединяют с концентратом (75 мл), прошедшим ультрафильтрацию на волокнах с размером пор 5 кДа, и наносят смесь на колонку с карбоксиметилцеллюлозой фирмы "Ватман", уравновешенную водой. Сорбцию ОИП осуществляют при рН 5,2, а десорбцию - 0,5 М раствором хлорида натрия при том же рН. Полученный элюат подвергают обессоливанию диафильтрацией, стерилизующей фильтрацией и лиофильной сушке.

Выход ОИП составил 640000 Е/кг с активностью 8500 КИЕ/мг.

Таким образом, предлагаемый способ получения ОИП позволяет, по сравнению со способом-прототипом, повысить выход целевого продукта в 1,4 раза и повысить чистоту по удельной активности с 6500 до 8500 КИЕ/мг.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и касается способа получения основного ингибитора протеиназ из органов крупного рогатого скота, включающего измельчение исходного сырья, экстракцию водным раствором соляной кислоты при рН 1,9-2,1 в присутствии хлорида натрия в количестве 15-16 г на 1 л смеси в течение 10-12 ч, концентрат после первой стадии ультрафильтрации не отбрасывают, а очищают от липидов и балластных белков, для чего доводят рН последнего до 4,8-5,2, нагревают до 75-77^oС с последующим охлаждением до 20^oС, выпавший осадок отделяют центрифугированием, полученный центрифугат объединяют с концентратом, прошедшим ультрафильтрацию на полых волокнах с размером пор 5 кДа и направляют смесь на хроматографическую очистку. Технический результат: повышение выхода и чистоты целевого продукта. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ получения основного ингибитора протеиназ из органов крупного рогатого скота, включающий измельчение исходного сырья, экстракцию в кислой среде, отделение жмыха центрифугированием, концентрирование экстракта ультрафильтрацией на полых волокнах сначала с размером пор 50 кДа, а затем 5 кДа и очистку целевого продукта хроматографией на карбоксиметилцеллюлозе, отличающийся тем, что экстракцию проводят водным раствором соляной кислоты при рН 1,9-2,1 в присутствии хлорида натрия в количестве 15-16 г на 1 л смеси в течение 10-12 ч, концентрат после первой стадии ультрафильтрации не отбрасывают, а очищают от липидов и балластных белков, для чего доводят рН последнего до 4,8-5,2, нагревают до 75-77^oС с последующим охлаждением до 20^oС, выпавший осадок отделяют центрифугированием, полученный центрифугат объединяют с концентратом, прошедшим ультрафильтрацию на полых волокнах с размером пор 5 кДа, и направляют смесь на хроматографическую очистку. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что подщелачивание концентрата осуществляют 0,5 М раствором NаOH. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сорбцию целевого продукта на карбоксиметилцеллюлозе проводят при рН 4,8-5,2, а десорбцию 0,5 М раствором хлорида натрия при том же рН.