Способ определения активности антилизосомной сыворотки Советский патент 1974 года по МПК C12K1/00 

1

Изобретение относится к области медицины и касается способов определения активности экспериментальных и диагностических препаратов.

Известен способ определения активности антилизосомных сывороток, согласно которому их соединяют с макрофагами в присутствии комплемента с последующим исследованием в фазоконтрастпом микроскопе.

Однако указанный способ не позволяет судить о характере действия этих сывороток на лизосомы живой клетки и дать количественную оценку этого действия.

Целью изобретения является устранение указанного недостатка.

Для достижения поставленной цели используют макрофаг, прижизненно коньюгированный с акридиновым оранжевым (АО) и подвергают люминесцентному исследованию.

Пример. Трех-четырехдневную культуру перитонеальных макрофагов белых мышей инкубируют на покровных стеклах в течение 2-3 ч при 37°С с различными разведениями аптилизосомной сыворотки, прогретой при 56°С в течение 30 мин с добавлением предварительно оттитрованного комплемента (обычно 1:10). Инкубацию проводят в среде 199 с добавлением 10% нормальной бычьей сыворотки.

До или после контакта с антилизосомной сывороткой макрофаги флюорохромируют раствором АО ( мкг/мл) в такой же среде в течение 30 мин при 37°С. В случае флюохромирования до инкубации с сывороткой макрофаги отмывают в среде без АО в течение 18 ч при 37°С. После инкубации со смесью антилизосомной сыворотки и комплемента и флюорохромирования покровные стекла с культурой макрофагов помещают клетками вниз на предметное стекло, оставив капиллярное пространство, заполненное средой 199 или раствором Хенкса, и просматривают в люминесцентном микроскопе. Для доказательства специфического характера лизиса лизосом красных цитоплазматических гранул (лизосом макрофагов) в присутствии антилизосомной сыворотки и комплемента используют следующие контроли: флюорохромированные макрофаги без инкубации с антисывороткой; флюорохромированные макрофаги, инкубированные со смесью нормальной сыворотки и комплемента; флюорохромированные макрофаги, инкубированные с прогретой при 56°С антилизосомной сывороткой без добавления комплемента; флюорохромированные макрофаги, инкубированные с комплементом без добавления сывороток.

При люминесцентной микроскопии с большим увеличением (об. 90х, ок. 7х) препаратов, инкубированных с антилизосомной сывороткой и комплементом, видны обычно два типа клеток: 1 - нормальные макрофаги, имеющие типичную морфологию, ядро, люминесцирующее тускло-зеленым с более яркими ядрышками и ядерной мембраной, и цитоплазму, заполненную преимущественно в околоядерной области, ярко-красными цитоплазматическими гранулами (КЦГ), которые, как указывалось выше, по данным ряда авторов, являются лизосомами и 2-макрофаги типичной морфологии или округлившиеся с пикнотичным ядром, люминесцирующим ярко-зеленым, и тускло-зеленой цитоплазмой, полностью лишенной КЦГ.

Соотношение количества этих клеток в поле зрения зависит от разведения сыворотки и является критерием ее активности. Эти клетки различаются и при малом увеличении люминесцентного микроскопа (об. 10-40х, ок. 7-8х) как «красные (нормальные, содержащие КЦГ) и «зеленые (лишенные КЦГ), и их соотношение в поле зрения может быть легко подсчитано.

Во всех контрольных препаратах наблюдались только типичные макрофаги, содержащие КЦГ.

При определении активности сыворотки достаточно использовать в качестве контроля добавление прогретой антилизосомной сыворотки без комплемента. Контрольными служат также максимальные разведения антилизосомной сыворотки, не оказывающие в

присутствии комплемента литического действия на лизосомы.

Проведенные исследования свидетельствуют о специфическом литическом действии антилизосомных сывороток в присутствии комплемента на лизосомы живых макрофагов, причем количество клеток с лизированными лизосомами зависит от активности сывороток.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет проводить количественную оценку активности антилизосомных сывороток по их действию на лизосомы живых макрофагов путем подсчета соотношения «красных и «зеленых клеток при малом увеличении люминесцентного микроскопа, что обеспечивает быстроту подсчета большого количества клеток, необходимого для статистической достоверности полученных данных. За титр сыворотки целесообразно принять разведение, при котором количество клеток без КЦГ составляет 50%.

Предмет изобретения

Способ определения активности антилизосомной сыворотки путем соединения макрофага с сывороткой и последующим микроскопическим исследованием, отличающийся тем, что, с целью количественной оценки активности, макрофаг прижизненно коньюгируют с акридиновым оранжевым и подвергают люминесцентному исследованию.