СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСЛА ФАГОСОМ В ФАГОЦИТАХ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может быть использовано при проведении медико-биологических исследований, связанных с изучением препаратов, оказывающих влияние на процесс фагосомо-лизосомного слияния.

Известен аналогичный способ определения фагосомо-лизосомного слияния [1 и 2 ].

Известен также способ определения фагосомо-лизосомного слияния в фагоцитах путем окраски их и объекта фагоцитоза акридиновым оранжевым с последующим изучением препаратов при помощи люминесцентной микроскопии [1 и 2].

Прототип обладает следующими недостатками. Невозможно выявить на окрашенных препаратах мелкие бактерии и кокки, находящиеся в фаголизосомах, так как они плохо различимы на фоне ярко окрашенных лизосом, а фаголизосомы с кокками невозможно отличить от таких же по форме и размерам лизосом. Относительно большая толщина фагоцитов и среды, в которой они заключены под покровным стеклом, создает светорассеяние и дополнительно ухудшает качество изображения.

Целью изобретения является улучшение качества изображения фагосом и фаголизосом и установление максимально точного количества бактерий, находящихся в фагоцитах, в фагосомах и фаголизосомах.

Это достигается за счет раздавливания фагоцитов с находящимися в них бактериями под покровным стеклом, что приводит к разрыву цитоплазмы и распределению лизосом, фагосом и фаголизосом в один слой. Препарат значительно уплощается, снижается фоновая флуоресценция и светорассеяние, повышается качество изображения этих внутриклеточных образований и их разрешающая способность (так как они распределены в один слой). Предварительная окраска бактерий и подсчет их в неокрашенных фагоцитах позволяет определить общее количество фагоцитированных бактерий, которые находятся в фагосомах и фаголизосомах. В окрашенных фагоцитах этого сделать нельзя, так как часть бактерий экранируется ядром или неразличима на фоне ядра, окрашенного в ярко зеленый цвет. Поэтому невозможно определить точное количество фагосом на окрашенном препарате и соответственно процент фаголизосом. Изучение неокрашенных и окрашенных фагоцитов, захвативших предварительно окрашенные бактерии, позволяет более точно определить процентное соотношение этих внутриклеточных образований. Если обозначим n₁ - количество бактерий, находящихся в 100 неокрашенных фагоцитах, n₂ - количество бактерий, окрашенных в зеленый цвет, находящихся в 100 окрашенных фагоцитах, а n₃ - количество окрашенных в красный цвет бактерий, находящихся в 100 окрашенных фагоцитах, то точное количество n₂ можем определить из формулы: n₂ = n₁ - n₃, а затем уже легко определить процентное соотношение фагосом и фаголизосом, что и укажет на степень фагосомо-лизосомного слияния.

Использование: экспериментальная биология и медицина. Цель изобретения - улучшение качества изображения. Сущность изобретения: проводят исследование раздавленных под покровным стеклом неокрашенных и окрашенных фагоцитов, в которых лизосомы, фагосомы и фаголизосомы распределены в один слой, причем на неокрашенном препарате подсчитывается количество окрашенных в зеленый цвет бактерий (сумма фагосом и фаголизосом), а на окрашенном препарате подсчитывается количество окрашенных в красный цвет бактерий (фаголизосом). Расчет ведется на 50 - 100 фагоцитов путем вычитания из числа бактерий, окрашенных в зеленый цвет на первом препарате, числа бактерий, окрашенных в красный цвет на втором препарате. Полученная разница указывает на число фагосом и на истинное процентное содержание фаголизосом.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСЛА ФАГОСОМ В ФАГОЦИТАХ, включающий окраску объекта фагоцитоза и препарата живых клеток акридиновым оранжевым с последующим анализом при помощи люминесцентной микроскопии, отличающийся тем, что дополнительно проводят анализ неокрашенного препарата, на котором подсчитывают окрашенные в зеленый цвет бактерии, по которым судят о количестве фагосом и фаголизосом, а на окрашенном препарате подсчитывают окрашенные в красный цвет бактерии, по которым судят о количестве фаголизосом, и по разнице между двумя полученными показателями судят о числе фагосом и процентном содержании фаголизосом.