СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ АНАПЛАЗМОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ПУТЕМ ГИПЕРИММУНИЗАЦИИ КРОЛИКОВ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/395 

Способ получения анаплазмозной сыворотки для реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) относится к методам лабораторной диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота и может быть использован в ветеринарной медицине.

Известны способы получения диагностических сывороток при бруцеллезе, лептоспирозе животных путем гипериммунизации кроликов, используемые для РНИФ, ранее описанные в рефератах российских патентных документов за 1994-2007 г.г. (№№2257581 2005.07.27, 95117746 1997.10.10).

Однако известные способы обладают следующими недостатками: длительные сроки гипериммунизации и невысокие титры образующихся в крови кроликов антител и низкая активность полученных сывороток.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ получения микоплазмозных сывороток для РНИФ путем гипериммунизации кроликов по схеме D.Shimmel (1967) в модификации Новиковой Н.Н. (2002). (Новикова Н.Н. Экспресс-методы диагностики ассоциативного урогенитального микоплазмоза плотоядных: дис… канд. вет. наук.: 16.00.03. / Н.Н.Новикова; - Новосибирск - 2002. - С.55-60), который проводится следующим образом:

1. Для гипериммунизации используются трехсуточные культуры микоплазм (M.fermentans, M.canis, M.laidlawii, U.urealyticum). Культуральную жидкость центрифугируют при 6 тыс.оборотах /мин в течение часа. Осадок после трехкратного ресуспендирования в физиологическом растворе и последующего центрифугирования доводят до концентрации 1,7 млрд микробных тел в 1 мл по бактериальному стандарту мутности.

2. Гипериммунизацию проводят на 12 кроликах (по 3 головы на каждый штамм) весом 2,5-3 кг. Суть гипериммунизации состоит в дробном внутривенном введении антигена кроликам каждые три дня с двукратным применением иммуностимулятора левамизола подкожно (табл.1).

Таблица 1 Схема гипериммунизации кроликов культурами микоплазм Время введения, сут. 1 4 7 10 13 16 20 24 Доза антигена, млрд м.т. 0,85 1,7 1,7 1,7 3,4 3,4 3,4 3,4 Левамизол, мл 1 1 - - - - - -

Динамику синтеза антител изучают на 7, 14, 21 и 30 сутки после первого введения антигена в реакции непрямой иммунофлюоресценции, которую ставят на предметных стеклах по стандартной методике, учет реакции проводят в крестах, свечение менее чем на два креста считают отрицательным. В качестве антигенов в РНИФ применяют 1 млрд взвеси микоплазм, инактивированных на водяной бане при 70°С - 30 мин. На 30-е сутки всех кроликов тотально обескровливают и получают микоплазмозные диагностические сыворотки.

Таблица 2 Динамика синтеза антител у кроликов, гипериммунизированных культурами микоплазм Сроки взятия крови (дни) Титр антител 7-й день 1:40 14-й день 1:160 21-й день 1:320 30-й день 1:640

Наиболее высокий уровень антител регистрируется на 21-30 дни после гипериммунизации, который колеблется в пределах 1:320-1:640 соответственно (табл.2).

Целью нашего изобретения является получение анаплазмозной сыворотки для диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота в реакции непрямой иммунофлуоресценции путем гипериммунизации кроликов.

Поставленная цель достигается при соблюдении ряда приемов:

1. получение антигена из культуры Anaplasma sp. Omsk (нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК (AY649325) данного штамма депонирована в Международном компьютерном банке данных GenBank (AUTHORS: Rar V.A., Bejsembaev K.K., Rudakov N.V., Krasikov A.P., Morozova O.V., штамм анаплазм «Омск/2004» депонирован во Всероссийском музее риккетсиозных культур НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН под инвентарным №138 от 19.09.2005).

2. гипериммунизация кроликов путем дробного внутривенного введения антигена каждые три, четыре дня с применением иммуностимулятора левамизола.

Описание метода получения сыворотки:

Для гипериммунизации используется восьмисуточная культура полевого штамма А. sp. Omsk, полученная на культуре клеток Vero. Заражение культур клеток Vero проводили приготовленной суспензией из селезенки от больной анаплазмозом коровы. Культуру клеток Vero выращивали в стеклянных флаконах в концентрации 150 тыс. на 1 мл. В качестве питательной среды использовали среду Игла MEM с двойным набором аминокислот, с добавлением 10% эмбриональной сыворотки и антибиотиков (пенициллин в дозе 1 млн ЕД и стрептомицин в дозе 500 тыс. ЕД на 1 мл). На следующие сутки после образования монослоя проводили замену среды роста на среду поддержки (Игла MEM с добавлением 1% эмбриональной сыворотки). Подготовленные флаконы заражали суспензией, полученной из селезенки, в дозе 0,5 мл на флакон. Флаконы с зараженными клетками Vero центрифугировали при 800 оборотов / мин при температуре 22°С в течение 1 часа, после центрифугирования среду меняли на свежую среду поддержки. Флаконы помещали при анаэробных условиях и 36°С на 8 суток. После завершения инкубации все флаконы промораживали при -20°С в течение 30 мин, а затем оттаивали при +18°С. После оттаивания, клеточную взвесь центрифугировали при 3 тыс. оборотов / мин в течение 15 мин и для дальнейшей работы отбирали супернатант. Для накопления антигенной биомассы, анаплазмы пассировались до 8 раз.

Для выделения анаплазм из клеток использовали указанный выше способ попеременного замораживания и размораживания и центрифугирования клеточной взвеси. Для дальнейшей работы использовали супернатант, который дополнительно центрифугировали при 6 тыс. оборотов / мин в течение часа. Полученный осадок трижды отмывали стерильным физиологическим раствором, центрифугируя в том же режиме, и доводили до концентрации 1,7×10⁹ микробных тел в 1 мл по ОСМ ГИСК им. Л.А.Тарасовича. Гипериммунизацию проводили на 3 кроликах породы шиншилла весом 2,5-3 кг по схеме, указанной в табл.3.

Таблица 3 Схема гипериммунизации кроликов культурами анаплазм Время введения, сут. 1 4 7 10 14 18 22 30 Доза антигена, млрд м.т. 0,85 1,7 1,7 1,7 3,4 3,4 3,4 Полное обескровливание Левамизол, мл 1 1 - - - - -

Титры антител учитывали на 7, 14, 22 и 30 и 37 сутки после введения A. sp. Omsk в РНИФ, антиген для которой готовили из этого же штамма и использовали после инактивации в водяной бане при 70°С в течение 30 мин в концентрации 1 млрд м.т.

Из полученной гипериммунной сыворотки готовили ряд последовательных двукратных разведений на физиологическом растворе, начиная с 1:5. Разведения делали микродозатором в пластиковых планшетах.

Ход определения:

Реакцию непрямой иммунофлюоресценции ставили по следующей методике. На чистые тщательно обезжиренные без царапин предметные стекла наносили параллельно друг другу несколько капель антигена. Антигены высушивали и фиксировали над пламенем спиртовки. Затем на каждую каплю антигена наносили равную по объему каплю сыворотки из каждого разведения, начиная с последнего. Одновременно ставили контроль:

1. антиген + сыворотка положительная;

2. антиген + сыворотка отрицательная;

3. антиген + физиологический раствор.

Стекла выдерживали во влажной камере при 37-38°С, в течение 50-60 мин для образования комплекса антиген - антитело. После чего их промывали дистиллированной водой от несвязавшихся антител, подсушивали и наносили в красящем титре (подобранном опытным путем) ослиный антикроличий глобулин, меченный ФИТЦ. Затем стекла помещали на 15-20 мин во влажную камеру при температуре 37-38°С. По истечении этого времени мазки промывали дистиллированной водой, просушивали и просматривали в люминесцентном микроскопе.

Интенсивность свечения оценивали в крестах: очень яркая люминесценция по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с телом клетки - ++++; яркая люминесцирующая периферия клетки - +++; слабое свечение периферии клетки - ++ или +; при отрицательной реакции люминесценция клеток отсутствует. За положительный результат принимали яркое специфическое свечение контуров микробов в виде ободков с оценкой в 3 и 4 креста; сомнительные результаты оценивали в 2 креста при наличии слабого свечения контуров клеток.

При этом высокий уровень антител регистрировали на 22-30 сутки после начала гипериммунизации, который колебался в пределах от 1:160 до 1:320 (табл.4).

Таблица 4 Динамика синтеза антител у кроликов, гипериммунизированных культурами анаплазм Сроки взятия крови (дни) Титр антител 7-й день 1:40 14-й день 1:160 22-й день 1:160 30-й день 1:320 37-й день 1:160

Контроль на видовую специфичность и активность полученной анаплазмозной сыворотки в РНИФ.

Для изучения видовой специфичности и активности использовали кроличьи анаплазмозные сыворотки в разведениях: 1:10, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, анаплазмозный антиген, полученный выше описанным способом, и гетерологичные антигены (табл.5). Сыворотка, полученная путем гипериммунизации кроликов анаплазмами, в разведении 1:5 давала перекрестную реакцию с микоплазмозными, бруцеллезными, хламидиозными и вирусом ИРТ-ПВ антигенами, а в разведениии 1:10 была строго специфична к анаплазмозному антигену с высоким уровнем активности антител в титре 1:320.

Таблица 5 Специфичность и активность анаплазмозной кроличьей сыворотки в РНИФ Антигены Разведения анаплазмозной сыворотки 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 Anaplasma sp. Omsk + + + + + + + Микоплазмы + - - - - - - Бруцеллы + - - - - - - Хламидии + - - - - - - Листерии - - - - - - - Лептоспиры - - - - - - - ИРТ-ПВ + - - - - - -

Способ относится к методам лабораторной диагностики анаплазмоза и может быть использован в ветеринарной медицине. Способ состоит из введения кроликам антигена и иммуностимулятора левамизола. При этом в качестве антигена используют антиген, извлеченный путем попеременного замораживания и оттаивания выращенной на клетках Vero в питательной среде поддержки роста Игла MEM с добавлением эмбриональной сыворотки, аминокислот и антибиотиков живой культуры Anaplasma sp. Omsk после восьми суточной инкубации. Способ позволяет получить анаплазмозную сыворотку с высоким диагностическим титром антител. 5 табл.

Способ получения анаплазмозной диагностической сыворотки для реакции непрямой иммунофлуоресценции путем гипериммунизации кроликов, состоящий из введения кроликам антигена и иммуностимулятора левамизола, отличающийся тем, что в качестве антигена используют антиген, извлеченный путем попеременного замораживания и оттаивания выращенной на клетках Vero в питательной среде поддержки роста Игла MEM с добавлением эмбриональной сыворотки, аминокислот и антибиотиков живой культуры Anaplasma sp. Omsk после восьмисуточной инкубации.