Способ моделирования синтеза ревматоидного фактора Советский патент 1974 года по МПК A61B10/00 G01M33/16 

Изобретение относится к области медицины.

Известна модель индукции ревматоидного фактора .при трансплантации органов путем стимуляции клеток иммунной системы аллогеннои тканью.

Однако известная модель затрудняет изучение механизмов образования ревматоидного фактора.

С целью упрощения и стандартизации методики его получения по предлагаемому способу производят in vitro взаимодействие культуры лимфоидных клеток периферической .крови человека с первичной культурой аллогенных фибробластов С пос„тедующим определением ревматоидного фактора в надосадочной жидкости.

СпосОб моделирования синтеза ревмато.идного фактор in vitro 1включает следующие этапы: получение лимфоцитов периферической крови здаровых лиц; приготовление первичной культуры фибробластов эмбриона человека; методику внесения и культивирования лимфоцитов в культуре аллогенных фибробластов, в числе и в присутствии винбластина; методику обнаружения ревматоидного фактора.

Получение лимфоцитов перифер.ическон крови здоровых лиц. Культуру лейкоцитов получают методом осаждения венозной гепаринизированной крови. Лейкоконцентрат дважды отмывают от плаз.мы средой 199 центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и заливают 10 мл этой среды на 20%-ной телячьей сыворотке. На следующий день надосадок слнвают, и лейкоцитарную массу, состоящую из лил фоцитов, ресусиендируют в этой питательной среде из расчета 2 л/л на 2Х10в клетоа.

Приготовление тр11нс11Н1131фованиых культур тканей эмбриона человека. Шести-двенадцати недельные человеческие эмбрионы сразу после доставки трижды отмывают раствором гидролнзат-лактальбумина с высокой концентрацией антибиотиков (1000 ед пенициллина и 1000 ед стрептомицина на 1 мл среды), затем отбирают кожномышечную ткань, отмывают этим растворо.м, измельчают стерильными ножницами до .кашеобразного состояния и помещают в колбу для трипсинизации. В эту колбу добавляют подогретый до 37°С 0,25%-ный раствор трипсина «Дифко в таком количестве, чтобы осевшая ткань была покрыта слоем жидкости 1,5-2 см. Во время инкубации ткань постоянно в течение о мин встря.х.ивают, затем трипсинизнровапную взвесь клеток удаляют ив ткань вносят свежую иорцию трипсина. Взвесь клеток в обеих порциях трипсина центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, ресуспендпруют и разводят питательной средой (гидролизат-лактальбумина, 10-1|5%-ная телячья сыворотка с добавленне.м 100 ед иенициллина н 100 ед степто.мицина с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 500 000 клеток). Полученную взвесь в количестве 2 мл разл,ивают в стерильные иенициллиновые флаконы, которые помещают в термостат при 37°С.

Методика внесения и культивирования мелифоцитов в культуре аллогенных фибробластов, в том числе и в присутствии винбластина. Лимфоциты периферической крови в количестве 2Х10 клеток IB 2 мл среды 199 иа 20%-ной телячьей сыворотке Вносят в односуточную первичную культуру аллогенных фибробластов после удаления из iree питательной среды. В ряде опытов взвесь лимфоцитов, вносимая в МО.НОСЛОЙ фибробластов, содержала 1 мг vinblastine sulfurici. Культивирование иронзводят в термостате ири 37°С. Одновременно с основным опытом, включающим нробы с винбластином, ставят контроли на отсутствие спонтанной продукции ревматоидного фактора: взвесь лимфоцитов нериферичеокой крови здоровых лиц; первичная культура аллогенных фибробластов.

Через 24-96 час культивирования в надосадочных л идкостях опытных и контрольных проб .производят обнаружение ревматоидного фактора.

Методика обнаружения ревматоидного фактора. Дерматоловую иробу используют как дающую наиболее специфические результаты. Суспензию дерматолога (1 г дерматолога в 25 мл натрий-боратного буфера рН 8,2) тп1ателыю размешивают и оставляют на 1 час при комнатной температуре. После оседания крупных частиц верхнюю прозрачную жидкость отсасывают а1илет1кой, а средпий слой сливают и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают и взвесь дер.матола ресуснендируют в 1 мл натрнй-боратиого буфера. К суспензии частиц осторожно по стенке добавляют 0,2 мл

0,5%-ного амнульного раствора человеческого у-глобулнна и оставляют на 30 мин нри комнатной температуре. Реакцию ставят на стекле. К последовательным двойным разведениям (1:2, 1:4, 1:8... 1:128) исследуемого образца

трех-, четырехсуточной надосадочной жидкости добавляют дерматоловые частицы, нагруженные у-г-юбулнном. Результат )Ч 1тывают визуа.1ьно 1 нод микроскопом через 2-4 мин. Оценивают реакцию по разведениям надосадочной жидкости, вызывающей агглютинацию половины и более дерматоловых частиц.

Пред .м е т и з о б р е т е и н я

Способ моде.чирования синтеза ревматоидиого фактора иуте.м стимуляции клеток иммуиiioii системы аллогенной тканью, отличающийся тем, что, с целью упрощения н стандартизации методики его получения, производят in vitro взаимодействие культуры лимфоидных клеток периферической крови человека с первичной культурой аллогенных фибробластон с последующим онределением ревматоидного фактора в надосадочиой жидкости.