Способ получения стимулятора иммуногенеза Советский патент 1975 года по МПК A61K27/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА ИММУНОГЕНЕЗА

I

Изобретение относится к области медицины и касается стимуляторов иммуногенеза.

Известен снособ получения стимулятора иммуногенеза путем гомогенизации микроорганизмов тина Mycobacteria или jMocardia и обработки гомогената органическими растворителями.

Целью изобретения является снижеиие токсичности нренарата.

Для достн/кения поставленной цели гомогеиат перед делинидизацией обрабатывают протеолитическими ферментами, лиофилизируют, обрабатывают ацетатом аммония, повторно подвергают обработке протеолитическими фермеитами н лиофилизации, а затем растворяют в воде и фракционируют, например, с использованием сефадекса G-50.

Пример 1. Штамм Mycobacterium smegmatis, культивируют в склянках Рюкса на среде Саутона в течение 12 дней, при 37°С, отфильтровывают, промывают дистиллированной водой и до непосредственного использования выдерживают при 20°С.

100 г клеток суспензируют в 500 мл дистиллированной воды путем смешивания при низких температурах в смесителе Уариига, который предварительно охлаждают до тех пор.

пока суспензия не становится гомогенной. Затем эти клетки расщепляют в предварительно охлаждаемом французском ирессовом устройстве, работающем в условиях комнатной темнературы при давленнн 420 кг/см. После первоначального прохождения через прессовое устройство добавляют 1 мг DNA-зы для снижения вязкости, и затем эту сусиензию вторично ироиускают через то устройство.

Кроме расщеиления клеток иутем воздействия механического давления, они могут быть расщеплены также звуковым колебанием 30 мл суспензии в течеиие 25 мнн в звуковом осцнлляторе, иредварительно охлажденном и работающем с частотой колебаний 70 кгц/сек, а также замораживанием оттаиваиием при обработке их цеолитом, встряхиванием их вместе со стеклянными шариками или обычными средствами, исиользуемыми для расщепления микробиых клеток.

Получаемую в результате суспензию цеитрифугируют три раза в течение 15 мин в количестве 800 г в охлаждаемой центрифуге. Шарики, состоящие из нерасщепленных клеток, удаляют. Получаемую всплывшую на поверхность жидкость центрифугируют в течеиие 1 час в количестве 27500 г. Шарики из

вещества стенки клеток превращают в суспензию 750 мл буферного раствора фосфата натрия (0,066 М; рН 7,8), в которую добавляют 125 мл трипсина, 125 мл химотрипсина и небольшое количество антисептического агента (например, толуол), чтобы предотвратить какое-либо бактериальное загрязнение. Этот продукт выдерживают в инкубаторе в течение ночи при обычной комнатной температуре с помощью магнитной мещалки, и после этого смесь центрифугируют 1 час. Шарики, состоящие из вещества стенки клеток, промывают, помещая их снова в суспензию, центрифугируя три раза вместе с холодным буферным раствором фосфата и три раза вместе с холодной дистиллированной водой.

Далее вещество стенки клеток делипидируют при обычной комнатной температуре с помощью нейтральных растворителей. С этой целью материал помещают в суспензию примерно в 30 объемов растворителя, который может воздействовать примерно в течение одного дня при перемещивании. Вещество стенки клетки, таким образом, делипидируют три раза ацетоном, три раза этанолом-эфиром (1 : 1), три раза хлороформом и три раза хлороформом-метанолом (2:1), затем это вещество высущивают с помощью ацетона. Делипидированное и высушенное вещество стенки клетки до его непосредственного использования можно выдерживать при комнатной температуре.

100 г делипидированного вещества стенки клетки суспензируют в 250 мл 0,1 М-ного раствора ацетата аммония, с рН 6,2 и выдерживают эту суспензию в течение ночи в холодном состоянии, добавляя несколько капель толуола. Вещество фильтруют, используя фильтр из сплавленного стекла, промывают этанолом и хлороформом. Промытый материал помещают снова в суспензию в 150 мл ацетата аммония (0,1 М; рН 6,2), к которому добавлено 12 мг лизозима и несколько капель толуола; этот продукт выдерживают в течение ночи в инкубаторе при 37°С и перемещивапии. После фильтрации с помощью сплавленного стекла остаток обрабатывают еще раз лизозимом в тех же условиях, что и первоначально.

Оба фильтрата смешивают, лиофилизируют, снова растворяют в во/ч,е и лиофилизируют до удаления ацетата аммония. Выход: примерно 90 мг сырого растворимого в воде продукта на 1 г высушенного делинидированного вещества стенки клетки.

Растворимый в воде сырой продукт (500 мг) фильтруют через колонку, наполненную Sephadex G-50 (высота колонки 80 см, диаметр 2,5 см) в равновесии с 0,1 N-ной уксусной кислотой.

Первый иик выходящего из колонки продукта, хорошо отделенного от оставшегося продукта, содержит рассматриваемый в данном описании агент в чистом виде (150 мг).

Фильтрация через колонку, наполненную Sephadex G-75, приводит к более размытому пику выхода, включающему плечо.

Этот пик выхода продукта содержит две фракции одинакового состава, различающиеся лишь по молекулярному весу.

Франкции, соответствующие второму пику выхода продукта при фильтрации через колонку, наполненную Sephadex G-50 содержат вещества с более низким молекулярным весом.

Предмет изобретения

Способ получения стимулятора иммуногенеза путем гомогенизации микроорганизмов типа Mycobacteria или Nocardia и делипидизации гомогената, отличающийся тем, что, с целью снижения токсичности препарата, гомогенат перед делипидизацией обрабатывают протеолитическими ферментами, лиофилизируют, обрабатывают ацетатом аммония, повторно нодвергают обработке протеолитическими ферментами и лиофилизации, а затем растворяют в воде и фракционируют, например, с использованием сефадекса G-50.