Способ получения тимозина Советский патент 1982 года по МПК A61K35/56 

Изобретение относится к медицине, в частности к получению сходно гормонального вещества под общим названием Тимошин или гормональный тимусный фактор (ГТФ), обладающего выргокенной биологической активностью со специфическими функциями, главным образом в отношении иммунных явлений.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения тимозина, предусматривающий гомогенизацию вилочковой желюзы, центрифугирование, нагревание адосадочной жидкости с последующим охлаждением, обработкой ацетоном, осаждением белков и липидов и пропусканием полученной смеси через хроматографическую колонку.

Согласно известному способу свежий тимус крупного рогатого скота, взятый со льда, гомогенезируют в физрастворе, а затем центрифугируют. Надосадочную жидкость собирают и нагревают до и после удаления осадка -фильтруют через мелкоячейные фильтры (0,45), после обработки ацетоном, фильтрования и повторного осаждения при помоида

(N8) при рН 4,0, пропускают через хроматографическую колонку и получают чистый тимозин (5-я фракция) fl.

К недостаткам известного способа относится то, что он не позволяет получить максимальное количество целевого продукта, обладающего достаточной биологической активностью.

Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта и повышение его активности.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения тимозина, предусматривающему гомогенизацию ВИЛОЧКОВОЙ железы, центрифугирование, нагревание надосадочной жидкости с последующим охлаждением, обработкой ацетоном, осаждением белков и липидов и пропусканием полученной смеси через хроматографическую колонку, вилочковую железу каспийского тюленя 10-15 дневного возраста перед гомогенизацией очищают от соединительной ткани, гомогенат пропускают через ультраторакс и проводят полную дезинтеграцию оставшихся клеток ультразвуком, осаждение белков и липидов осуществляют добавлением 10 мМ раствора фосфорнокислоро натрия при рН « 7.07,2 и соотношении .1:9-1:10, далее центрифугируют, полученный супернатант подкисляют 10%гным раствором уксусной кислоты до рН 4,0-4,2, затем обрабатывают 50%-ньп 1 раствором сернокислого аммония, центрифугируют, к образовавшемуся осадку добавляют 10 мМ трис-хлор буфер при рН 8,О-В,2, лиофилизируют и до пропускания через хроматографическую колонку к полученному сухому осадку добавляют 10 мМ трис-хлор буфер. Способ осуществляют следующим об разом, Вилочковую железу (тимус) в замороженном состоянии () добав ляют в лабораторию и размораживают при комнатной температуре. Затем следует максимальная очистка тимуса от соединительной ткани, гомоге низация с физраствором в соотношении 1:3, ультраторакс, дезинтеграци .оставшихся клеток ультразвуков. По ле центрифугирования при 12000 g удаляют осадок, а супернатант (1-я фракция)нагревают до с последующим центрифугированием (45000 g Полученный супернатант является 2-й фракцией, которую затем при 4 обрабатывают ацетоном Спредварител но) охлажденным до в соотноше нии 1:5. Полученную смесь центрифу гируют (15000 g), после чего полученный осадок (3-я фракция) раство ряют 10 мМ раствором NaPO (рН 7,0) в соотношении 1:10, добавля ют (NH)S04 насыщенного раствора количестве 25% к предыдущему объему . После кратковременного центрифугирования полученный супернатант подкисляют 10%-ным раствором СНз,СО до рН 4,0 и добавляют 50%-ный раствор (NH)2.S04- Далее центрифугируют 15 мин, полученный осадок растворяют 10 мМ трис-С1 буфером (рН 8,0) и лиофилизируют (4-я фр ция) . После этого сухое вещество растворяют в минимальном количестве 10 мМ трис-С1 буфере и пропуска ют через хроматографическую колонк Sephadex сколлектором фракций для получения 5-й фракции ГФТ. Получен ный материал лиофилизируют. Пример. Каспийский тюлень Phoca ca.spica был добыт в марте 1980 г. на ледовых залежс1Х Северно го Каспия. Из препарированных туше были извлечены тимусы в количестве 1,0 кг и заморожены (). Через две недели размороженные при комнатной температуре железы были очи щены от соединительной и эпителиальной тканей, пропущены через мяс рубку и затем помещены на время (10-15 мин) в гомогенизатор. В образовавшийся гомогеиат добавляют физраствор. (0,15 М раствор NaCI) в соотношении 1:3 и продолжают обработку на ультратораксе в течение 10-12 мин. После этого весь материал центрифугируют 1 ч (12000 g) и после удаления осадка получают 1-ю фракцию. Надосадочную жидкость сливают в колбу с термостабильным стеклом и помещают в водяную баню, температуру в которой постепенно доводят до , затем вынимают колбу и охлаждают . Потом следует центрифугирование (45000 g) в течение одного часа, полученный супернатант является 2-й фракцией. Затем его помещают в холодильник () на 1/5 ч, после чего смешивают с охлажденным при -40°С ацетоном (ХЧ) в соотношении 1:5. Смесь центрифугируют (15000 g) при низкой температуре в течение одного-часа. Полученный осадок является 3-й фракцией ГФТ. Осадок затем растворяют в 10 мМ растворе NaPO (рН 7,0) в соотношении 1:10, добавляют (NN4)50 (насыщенного раствора) в количестве 25% к основному объему. После 15-ти минутного центрифугирования (3500 об/мин) полученный супернатант подкисляют 10%-ным раствором CHjCOOH до рН 4,0 и добавляют 50%-ный раствор (ННд), . Далее ц ентрифугируют смесь 20 мин (3500 об/мин), полученный осадок растворяют примерно в 500 мл (до полного растворения) 10 мМ трис-СI буфера (рН 8,0) и лиофилизируют (4-я фракция). После зтого высушенный материал растворяют в 50 мл трис-С1 буфера и пропускают через хроматографическую колонку Sephadex (G-50). Полученную таким образом фракцию с молекулярным весом 12200 подвергают лиофилизации (5-я фракция) . Вещество представляет собой белые кристаллы, хорошо растворимые в воде. Конечный выход-вещества из 1 кг сырого веса примерно 250 мг лиофилизированной 5-й фракции ГФТ, а выход аналогичного тимозина, полученного из тимуса крупного рогатого скота по известному способу соответственно, 120 мг. Для сравнения биологической активности стандартного тимозина и ГФТ из морских млекопитающях были поставлены серии опытов на линейных мышахГ(СВА. С57В1/6) , зараженных Salmonella tуphimuгiurn.Всего было заражего 90 мышей. Результаты опытов показывают, что действие ГФТ из морс них млекопитающих по своей активности 100%-я защиты от инфекции) выше аналогичного тимодина из крупного рогатого скота почти в 2 раза .

Биологическая активность стандарт HOFO тимоэина и тимозина из тимуса крупного рогатого скота представлена в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным. Позволяет увеличить выход целевого продукта в 2 раза.

Тимоэин, получаемый предлагаемым способом, обладает более биологической активностью ( действие тимозина, полученного предложенным способом, было вьые почти в 2 раза, чем тимозина, полученного известным способом 1.

Формула изобретения

Способ получения тимозина путём гомогенизации вилочковой железы.

центрифугирования, нагревания надосадочной жидкости с последующим охлаждением, обработкой ацетоном осаждением белков и липидов и пропусканием полученной смеси через хроматографическую колонку, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и повышения его активности, вилочковую железу каспийского

0 тюленя 10-15 дневного возраста перед гомогенизацией очищают от соединительной ткани, гомогенат пропускают через ультраторакс и проводят полную ;дезинтеграцию оставшикся

5 клеток ультразвуком, осаждение белков и липидов осуществляют добавлением 10 мМ раствора фосфорнокис-лого натрия при рН 7,0-7,2 и соотношении 1:9-1:10, далее центрифугируют, полученный супернатант подкис0ляют 10%-ным раствором уксусной кислоты до рН 4,0-4,2, затем обрабатывают 50%-ным раствором сернокислого аммония,. центрифугир5пот, к образовавшемуся осадку добавляют

5 10 мМ трис-хлор буфер при рН 8,08,2, лиофилизируют и до пропускания через хроматографическую колонку к полученному сухому осадку добавляют 10 мМ трис-хлор буфер.

0

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Goldstein А. Ргос. Nati. Acad, Sel. USA, 1972, 69, p. 1800.