Способ одновременного получения ингибитора протеазы и гепарина Советский патент 1978 года по МПК C12D13/10 C07G7/02 

(54) СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ПРОТЕАЗЫ И ГЕПАРИНА

вать в качестве исходного сырья околоушные железы или поджелудочные железы i-ши печень.

Протеопятическне ферменты, добавляемые для разделения лижла на две фазы, целесообразно вы&фать из . напшсна, фжщна и бромалина. Лизис можно прюкраищтБ путем нагревания лизата.

Пример 1. Измельченное легкое коровы в количестве 10 кг перемешали с 16 л дистиллированной воды и получили шлам. Массу нагре ш до 40°С при перемешивании, а затем в нее добавили суспензию из 20 г папаина, 4 л 0,25 М раствора буферного цитрата при рН 5,5 и 200 г сульфата магния. Температуру довели до 55°С, после чего массу вьщержади в таких условиях в течение 4 ч. Далее величину рН массы довели до 6,2 добавлением отдельными порциями концентрированной аммиачной воды после чего нагрели до 90 С. Затем массу профильтровали под давлением, а остаток сбросили в отход. Прозрачную Ж1щкость обработали цетллпиридиняем до полной флоккуляции полиаяиоиов. С целью отделения гапариносодержащего осадка полученную жидкость профильтровали и в нее добавили дополиителыюе количество трихлоруксусной кислоты до конегшой концентрации 3 По истечении 30 мин вновь профильтровали под давлением с промывкой фильтра 4 л 3-ной трихлоруксусной кислоты. Таким образом, получили гепарин, содержащий осадок, и 32 л прозрачной Ж1адкости, ингибирующая активность которой была равна 610 и. ед./см (и. ед.-единица ингибировакия Указанная активность эквивалента выходу 1,95 10 и.ед./кг исходной массы opraia. Далее этот раствор подвергли фракционированию с использованием сульфата аммония концентрацией 0,5-0,9 путем центрифугирования. Полу1шли 85 г осадка (ш1гибитора протеазы), содержащего 1,910 и.ед. (приблизительно 98% от общей активности, достигаемой в процессе лизиса). Содержание белкового материала было равно 36,5%, что соответствовало степени «шстоты 1,56 мкг/и.ед. Последующую

очистку провод1ши известными методами. В результате получили 465 мл апирогенного раствора активностью 32000 и.ед. см, т.е. всего 1,.ед. Это указывает на 76%-ньш выход по сравне1шю с первоначальной активностью. Степень щютоты, как это установили при анализе на белковый материал, составила 0,143 мкг/и.ед.

Пример 2. Процесс, вдентичный тому, которьш описан в примере 1, провели с заменой папаина фицином. Выход ингибитора протеида

был равным 2,03-10 и.ед./кг легкого в состоянии очии1ешн;ого продукта.

Пример 3. Измельченное легкое коро:Вы в количестве 5 кг перемешали с 8 л воды.Затем в шлам добавили 2 л суспензии, содержащей 10 г бромелина в фосфатаом 0,1 М буфере при рН, установленном путем подкисления 1.%-ным раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты. Эту массу осторожно нагрели до 37° С и при этой температуре вьщержали в течение 4 ч. По истечении этого промежутка времени температуру повысили до 90°С в течение 10 мин. После этого массу проф11льтрова)ш под давлением с промывкой на фильтре 2 л дистиллированной воды. Фильтрат охладили и обработали цетилтриметиламмонийбромидами до потщой флоккуляции полианионов причем хлопья осадка собрали на фильтре с целью вьщелить гепарин. Объем прозрачного фильтрата составлял 16 л, а его активность была равной 540 и.ед./см, что соответствовало выходу 1,735 яЮ и.ед./кг исходного органа животного. Дальнейшую очистку ингибитора протеазы осуществили по аналогии с изложенным в примере 1. Конечный выход очищенного продукта бьш равен 1,1810.ед легкого.

П р и М е р 4. 2,5 кг порошкообразного сухого легкого коровы подвергли экстрагированию по примеру 1. Конечньв выход ингибитора протеазы составил 3,2 10 и.ед./кг порошка.

Пример 5. Из 2,5 кг порошкообразного легкого коровы и 23,5 л дистиллированной воды приготовили шлам. После осторожного нагревания до 40° С с перемешиванием в него добавили суспензию из 40 г панкреатина в 4 л 0,2 М буферного раствора триэтаноламина при рН 8, содержащего 30 г хлористого кальция. При этой температуре {40° С) смесь вьщержали в течение 24 ч, после чего те шературу повысили до 90°С. Затем массу профильтровали под давлением. Фильтрат обработадш по аналогии с изложенным в примере 1. Конечный выход ингибитора протеазы составлял 4,2-10 и.ед./кг порошкообразного легкого в состоянии сырого продукта и 2,8«10° и ед./кг легкого в состоянии очищенного продукта.

Пример 6. Из 10 кг легкого коровы и 16 л дважды перегнанной воды приготовили шла При осторожном нагревании до 40° С в щлам добавили 500 г свежей поджелудочной железы коровы, которую предварительно измельчили и приготовили шлам в 4 л 0,2 М буферного триэтаноламинового раствора при величине рН 8, содержащего 30 г хлористого кальция.

Последующие операции проводили по аналогии с изложенным в примере 5. Конечный выход ингибитора протеазы составил 1,25 «10 и.ед./кг органа йотвотного в состоянии сырого продукта и 0,78010 и.ед/кг органа животного в состоянии очищешюго продукта.

Пример 7. 20 л жидкого экстракта легкого в ввде остатка от вьщеления гепарина чет вертичными аммониевыми основаниями подкислили добавлением трихлоруксусной кислоты до конечной ее концентрации 3%.. По истечении 60 мин массу профильтровали под давлением и промыли на фильтре 5-10 л 3%-ной трихлоруксусной кисло ты. Таким образом получили 23,2 л прозрачной жидкости, которая содержала 352 и.ед./см.

Далее эту жидкость подвергли фракционированию вьюаливанием сульфатом аммония при концентрации от 0,45 до 0,9 от концентрации насыщения. Таким образом получили 41 г осадка, общая

активность которого (после сбора осадка центрифугированием) составила 7,9-10 и.ед. Содержание белковых веществ 31,5%, что соответствовало удельной активности 1,63 мкг/и.ед.

В результате дополнительных операций очистки, которым подвергли этот осадйк, получили апирогенный раствор, который содержал 36000 и.ед./см. Конечный выход ингибитора протеазы составил 5, и.ед.т.е. 70% активности от той полной активности, которой характеризовался сырой материал. Удельная активность 0,141 мкг/м.ед.

Таким образом предлагаемьш способ обеспечивает поьышение чистоты получаемых препаратов а также направлен на усовершенствование очистки и решение проблемы, связанной с загрязнением окружающей среды, имевшим место при осуществлнии процесса получения ингибитора протеазы гепарина по известным способам.

Формула изобретения

1. Способ одновременного получения ингибитора протеазЬ и гепарина, предусматривающий осуществление лизиса животного сырья, прекращение лизиса, разделение лизата на фракции, извлечение гепарина, извлечение ингибитора протеазы из жидкой фракции лизата, растворение осадка ингибитора протеазы с последующим его фракционированием путем добавления сульфата аммония, о тличающийся тем, что, с целью повышения чистоты получаемых препаратов, лизис животного сырья осуществляют добавлением по крайней мере одного протеалитического фермента, разделение лизата на две фазы осуществляют путем добавления катионного поверхностно-активного вещества, а извлечение гепарина, как и ингибитора протеазы, осуществляют из жидкой фазы лизата.

2.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что в качестве исходного животного сырья используют околоушные железы или поджелудочные железы или печень.

3.Способ по П.1, отличающийся тем, что протеолитические ферменты выбирают из группы папаина, фищша и бромалина.

4.Способ по П.1, отличающийся тем, что лизис прекращают путем нагревания лизата.

5.Способ по П.1, отличающийся тем, что в качестве катионного поверхностно-актив ного вещества используют четвертичное аммониевое основание из группы цетилпиридиния и цетилтриметиламмонийбромипа.

Источники информации, принятые во внимание при зкспертизе:

1. Авторское свидетельство СССР № 377159, кл. С 07 G 7/02, 1970.