Ингибитор репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе водного экстракта гриба Inonotus obliquus Российский патент 2021 года по МПК A61K36/06 B01D11/02 A61P31/14 

Настоящее изобретение относится к ингибитору на основе водного экстракта гриба Inonotus obliquus коронавируса SARS-CoV-2, вызывающего тяжелый острый респираторный синдром COVID-19, обнаруженного в конце 2019 г. в Китае.

Вспышка SARS-CoV-2 по всему миру и связанные с ней последствия являются угрозой зоонозных заболеваний для общественного здравоохранения и экономики многих стран. Отсутствие специальной терапии против нового вируса требует создания новых лекарственных средств.

Природные вещества чаги (гриба Inonotus obliquus) имеют очень широкий спектр различных соединений, которые формируются при тесном взаимодействии березы и гриба [Чага и ее лечебное применение / Под ред. проф. П.К. Булатова, проф. М.П. Березиной, проф. П.А. Якимова / Медгиз, Ленинградское отделение, 1959). В Сибири и в целом в РФ этот гриб развивается на березе бородавчатой и березе белой (Betula pendula Roth, и Betula alba L.), имеет широкий ареал распространения.

После разносторонних клинических и химических исследований гриб Inonotus obliquus был разрешен Фармакологическим комитетом Министерства Здравоохранения СССР к использованию в 1955 году. На основании фармакопейной статьи ФС 42-53-72 готовое сырье гриба Inonotus obliquus имеет следующие показатели:

- экстрактивные вещества - не менее 20%;

-- хромогенный комплекс - не менее 50% массы общего сухого остатка экстрактивных веществ;

- влаги - не более 14%;

- золы - не более 14%.

Гриб Inonotus obliquus содержит широкий спектр различных БАВ: водорастворимые пигменты в большом количестве (20%), которые образуют хромогенный полифенолоксикарбоновый комплекс, проявляющий противоопухолевую активность, обусловленную тем, что фенольные соединения регулируют активность цитоплазматических и митохондриальных АТФ-аз и понижают образование АДФ, а поскольку магнилизированные клетки в большей степени, чем нормальные, зависят от гликолиза, то нарушение этого процесса негативно отражается на их развитии; птерины (производные птеридина), наличием которых обусловливается цитостатическое действие чаги; полисахариды (6-8%); агарициновая и гуминоподобная чаговые кислоты (до 60%); органические кислоты, суммарное содержание которыхсоставляет 0,5-1,3% (щавелевая, уксусная, муравьиная, ванилиновая, сиреневая, n-оксибензойная, а также 2 тритерпеновые кислоты из группы тетрациклических тритерпенов-инонотовая и обликвиновая; липиды (ди- и триглицериды); стероидные вещества (стерины -эргостерол, а также тетрациклические тритерпены-ланостерол и инотодиол, проявляющий антибластическую активность; лигнин; клетчатка;свободные фенолы; флавоноиды; кумарин пеуцеданин; целлюлоза; смолы; следы алкалоидов невыясненной структуры; зола (12,3%), богатая марганцем, который, возможно, имеет значение в лечебном действии чаги как активатора энзимов; другие микроэлементы в виде оксидов: медь, барий, цинк, железо, кремний, алюминий,кальций, магний. Препараты из гриба Inonotus obliquus нашли широкое применение в медицине.

Природное сырье чаги входит в государственную фармакопею СССР (одиннадцатое издание, выпуск 2, общие методы анализа, лекарственное растительное сырье, п. 63. Inonotus obliquus, чага), имеется в аптечной сети в виде измельченного природного сырья. Кусочки сырья должны проходить сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Цвет темно-коричневый. Запах отсутствует. Измельченная чага предназначена для использования в домашних условиях в виде отваров в качестве симптоматического средства при хронических гастритах, дискинезиях желудочно-кишечного тракта с явлениями атонии, при язвенной болезни желудка и онкологических заболеваниях. В рекомендациях разных поставщиков измельченной чаги в аптеки указан способ и дозы применения: 50 г измельченной чаги заливают 0,5 л теплой кипяченой воды, настаивают в течение 2-х суток при комнатной температуре, процеживают, доводят объем до 0,5 л, принимают внутрь по Vz стакана 6 раз в день или по 1 стакану 3 раза в день за 30 минут до еды. Есть рекомендации настаивать чагу с водой 48 часов при 50°С.

Присутствует также в аптеке препарат Бефунгин, представляющий собой концентрированный водный экстракт с добавлением кобальта сульфата гептагидрата (2 г), 95%-ного этилового спирта (100 г), воды очищенной - до получения 1 л препарата. Фармакологическое действие Бефунгина определяется эффектом входящих в его состав биологически активных веществ (полисахаридов, гуминоподобной чаговой кислоты, органических кислот, микроэлементов, стероидных и других соединений). Бефунгин регулирует метаболические процессы, повышает защитные силы организма, действует как укрепляющее средство. Показания к применению: в качестве симптоматического средства при хронических гастритах, дискинезиях желудочно-кишечного тракта с явлениями атонии, при язвенной болезни желудка и онкологических заболеваниях.

В связи со сложившейся в мире ситуацией с коронавирусом, особенно актуальными являются исследования биологически активных соединений из грибов, которые проявляют наибольшую эффективность в отношении вирусов гриппа. Одним из свойств чаги является ее способность улучшать реологию крови (повышать текучесть) (Hyun K.W., Jeong S.C., Lee D.H., Park J.S., Lee J.S. Isolation and characterization of a novel platelet aggregation inhibitory peptide from the medicinal mushroom, Inonotus obliquus. Peptides, 2006, Jun., 27(6), 1173-1178), что особенно важно при лечении от коронавируса SARS-CoV-2, который способствует образованию тромбов в сосудах.

Проведенный в ФБУН ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора скрининг на противовирусную активность экстрактов из грибов Западной Сибири показал, что самый широкий спектр активности проявляет гриб чага Inonotus obliquus [Косогова Т.А. Штаммы базидиальных грибов юга Западной Сибири - перспективные продуценты биологически активных препаратов: дисс. канд. биол. наук, 03.01.06. Кольцово, 2013. - 172 с.; Теплякова Т.В., Косогова Т.А. Высшие грибы Западной Сибири -перспективные объекты для биотехнологии лекарственных препаратов. Новосибирск, 2014. - 298 с.].

Известна протективная активность водного экстракта из чаги в отношении вируса гриппа (штамм пандемического вируса гриппа A/Moscow/226/2009 (Η1Ν1)ν) на культуре клеток MDCK и на животных [Кабанов А.С., Косогова Т.А., Шишкина Л.Н., Теплякова Т.В., Скарнович М.О., Мазуркова Н.А., Пучкова Л.И., Малкова Е.М., Ставский Е.А., Дроздов И.Г. Изучение противовирусной активности экстрактов, выделенных из базидиальных грибов, в экспериментах in vitro и in vivo в отношении штаммов вируса гриппа разных субтипов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2011. - №1. - С. 40-43.].

Известен ингибитор репродукции ВИЧ-1 [Патент РФ №2375073, опубл. 10.12.2009 г. ]. Водный или водно-спиртовый экстракт природных биологически активных веществ из базидального гриба Inonotus obliquus в определенной концентрации является эффективным ингибитором репродукции вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1). Для препарата (водного экстракта) из гриба Inonotus obliquus, 50%-ное подавление ВИЧ-1 достигается при концентрации препарата, меньшей 156 нг/мл. 100% подавление ВИЧ-1 достигается при добавлении 312 нг/мл препарата гриба Inonotus obliquus.

Однако патент описывает активность чаги только к вирусу ВИЧ-1.

Известны природные соединения, такие как флавоноиды [https://bionavit.ra/wp-content/uploads/Taxifolin-basel-rus2.pdf], которые ингибируют основную протеазу SARS-CoV-Ι, и их эффективность была продемонстрирована с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) [Pillaiyar, Т.; Manickam, Μ.; Namasivayam, V.; Hayashi, Y.; Jung, S. H. An overview of severe acute respiratory syndrome-coronavirus (SARS-CoV) 3CL protease inhibitors: Peptidomimetics and small molecule chemotherapy. Journal of Medicinal Chemistry 2016, 59, 6595-6628.].

Кроме того, в экспериментах in vivo (-) - таксифолин проявляет активность против других вирусов, таких как вирус Коксаки В4. Известно, что лиственница сибирская (Larix sibiricd) вырабатывает (-) - таксифолин, являющийся природным ресурсом для его экстракции. Кроме того, пищевые препараты, содержащие (-) - таксифолин, легко доступны в аптеках и некоторых компаниях, обеспечивая прямой и быстрый доступ к потенциальному противовирусному препарату. Примечательно, что (-) -таксифолин переносит семь водородных связей, что является самым высоким показателем в выборе противовирусных соединений. Поскольку водородные связи являются ключевым фактором, определяющим особенность лекарственного средства (-) - таксифолин может являться природной альтернативой предлагаемым ингибиторам CP-1-CP-11 [Wade, R.C.; Goodford, P.J. The role of hydrogen-bonds in drug binding. Progress in clinical and biological research. 1989, 289, 433-444.].

Известно также, что содержащийся в водорослях гепарин способен блокировать коронавирус SARS-CoV-2 лучше, чем, например, препарат "Ремдесивир", который активно используют в США для лечения COVID-19 [Sulfated polysaccharides effectively inhibit SARS-CoV-2 in vitro / Paul S. Kwon, Hanseul Oh, Seok-Joon Kwon, Weihua Jin, Fuming Zhang, Keith Fraser, Jung Joo Hong, Robert J. Linhardt & Jonathan S. Dordick. Cell Discovery, volume 6, Article number: 50 (2020)]. Ученые целенаправленно исследовали свойства гепарина - известного всем антикоагулянта. Было доказано, что это вещество обладает исключительным связывающим свойством к спайковому белку (S-белку) SARS-CoV-2 и снижает активность данного вируса.

Наиболее близким аналогом по назначению (прототипом) является ингибитор коронавируса SARS-CoV на основе водного растительного экстракта, проявляющего дозазависимую активность против SARS-CoV в тестах на клеточных культурах [заявка США №20080038382, МПК А61Р 31/12, опубл. 14.02.2008 г. ]. В качестве водного растительного экстракта он содержит водный экстракт многолетнего травянистого растения Scutellaria spp.(вид рода Шлемник) эффективный для лечения пациента с инфекцией SARS-CoV. Указанное средство ингибирует инфекционность SARS-CoV приблизительно на 50% при самой высокой использованной концентрации (200 мкг/мл). Эффект зависит от дозы, учитывая, что при испытанной более низкой дозе наблюдается меньшее ингибирование. Значительно ингибирование на более высоком уровне было больше, чем рибавирин (100 мкг/мл).

Однако указанный наиболее близкий аналог - ингибитор репликации коронавируса SARS-CoV не исследовался на активность против нового коронавируса SARS-CoV-2.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение нового природного ингибитора репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе водного экстракта из природного сырья и расширение спектра средств против указанного коронавируса.

Указанный технический результат достигается тем, что ингибитор репликации коронавируса SARS-CoV-2 характеризуется тем, что он содержит экстракт биологически активных веществ из базидального гриба Inonotus obliquus, полученный водной экстракцией при температуре 50-95°С в течение от 1,0 до 72 часов, ингибирующая концентрация которого в диапазоне 0,75-11,6 мкг/мл проявляет 50%-ную противовирусную дозазависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточных культурах Vero Е6 и Vero.

Изобретение поясняется чертежами, приведенными на фиг.1 -результаты измерения ОП (для образцов 20-26 и 20-13 ингибитора) в зависимости от концентрации препарата представлены в полулогарифмической системе координат.По оси абсцисс (X) приведена концентрация препаратов в логарифмической шкале измерения, а по оси ординат (Y) - ОП в линейной шкале измерения.

Ниже приведены варианты получения заявляемого ингибитора репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе водного экстракта природных биологически активных веществ, полученного из фармакопейного измельченного базидального гриба Inonotus obliquus.

Пример 1. Получение водного экстракта из природной чаги Inonotus obliquus, образец 20-15.

К 20 г сухого измельченного до 1 мм (на мельнице IKA WERKE MF-10) природного сырья чаги добавили 200 мл дистиллированной воды, выдержали 72 часа при 50°С в термостате. Затем профильтровали через капроновый фильтр, осадок осадили на центрифуге Centra CL3 4000 об/мин в течение 20 минут, высушили при 50±2°С. Растворение сухого экстракта для исследований провели в стерильной воде из расчета 2,0 мг в 1 мл.

Получен ингибитор репликации, содержащий водный экстракт прироцных биологически активных веществ, полученный из измельченного базидального гриба Inonotus obliquus в термостате при температуре 50°С водной экстракцией в течение 72 часов и имеющий:

- ингибирующую концентрацию (IC₅o) равную 2,766 мкг/мл и обеспечивающую 50%-ое подавление репликации коронавируса SARS-CoV-2 в клеточной культуре Vero Е6;

- ингибирующую концентрацию (IC₅o) равную 5,979 мкг/мл и обеспечивающую 50%-ое подавление репликации коронавируса SARS-CoV-2 в клеточной культуре Vero.

Пример 2. Получение водного экстракта из природной чаги Inonotus obliquus, образец 20-16.

К 20 г сухого природного сырья чаги, измельченного до 70-80 мкм в процессе механохимической обработки на роликовой мельнице типа РМ-1, разработанной в Институте химии твердого тела и механохимии СО РАН, добавили 200 мл дистиллированной воды, выдержали 72 часа при 50°С в термостате. Затем профильтровали через капроновый фильтр, осадок осадили на центрифуге Centra CL3 4000 об/мин в течение 20 минут, высушили при 50±2°С. Растворение сухого экстракта для исследований провели в стерильной воде из расчета 2,0 мг в 1 мл.

Получен ингибитор репликации, содержащий водный экстракт природных биологически активных веществ, полученный из измельченного базидального гриба Inonotus obliquus в термостате при температуре 50°С водной экстракцией в течение 72 часов и имеющий:

- ингибирующую концентрацию (IC₅₀) равную 3,7 мкг/мл и обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero Е6 от коронавируса SARS-CoV-2;

- ингибирующую концентрацию (IC₅₀) равную 5,578 мкг/мл и обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero от коронавируса SARS-CoV-2.

Пример 3. Получение водного экстракта из природной чаги Inonotus obliquus, образец 20-17.

К 200 г природного сухого сырья чаги, размером частиц от 0,1 до 7 мм, добавили 1 л водопроводной воды, выдержали на водяной бане при 95°С 3 часа, после фильтрования через капроновый фильтр раствор высушили при 50±2°С. Растворение сухого экстракта для исследований провели в стерильной воде из расчета 2,0 мг в 1 мл.

Получен ингибитор репликации, содержащий водный экстракт природных биологически активных веществ, полученный из измельченного базидального гриба Inonotus obliquus на водяной бане при температуре 95°С водной экстракцией в течение 3 часов и имеющий:

- ингибирующую концентрацию (1С₅о) равную 2,498 мкг/мл и обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero Е6 от коронавируса SARS-CoV-2;

- ингибирующую концентрацию (1С₅о) равную 2,16 мкг/мл и обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero от коронавируса SARS-CoV-2.

Пример 4. Получение водного экстракта из природной чаги Inonotus obliquus, образец 20-26.

20 г измельченной чаги с размером частиц 1 мм залили кипятком 200 мл и выдержали при комнатной температуре до полного остывания (в нашем случае 60 мин). Слили без осадка через капроновый фильтр. Содержание сухих веществ составило 9,4 мг в 1 мл.

Получен ингибитор репликации, содержащий водный экстракт природных биологически активных веществ, полученный из измельченного базидального гриба Inonotus obliquus (без термостатирования) при температуре 95°С водной экстракцией в течение 1 часа и имеющий ингибирующую концентрацию (1С₅₀) равную 11,609 мкг/мл, обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero от коронавируса SARS-CoV-2.

Пример 5. Получение водного экстракта из природной чаги Inonotus obliquus, образец 20-13.

К 20 г сухого измельченного до 1 мм (на мельнице IKA WERKE MF-10) природного сырья чаги добавили 200 мл дистиллированной воды, выдержали 48 часов при 50°С в термостате. Затем профильтровали через капроновый фильтр, осадок осадили на центрифуге Centra CL3 4000 об/мин в течение 20 минут, высушили при 50±2°С. Растворение сухого экстракта для исследований провели в стерильной воде из расчета 2,0 мг в 1 мл.

Получен ингибитор репликации, содержащий водный экстракт природных биологически активных веществ, полученный из измельченного базидального гриба Inonotus obliquus в термостате при температуре 50°С водной экстракцией в течение 48 часов и имеющий ингибирующую концентрацию (IC₅₀) равную 0,759 мкг/мл, обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero от коронавируса SARS-CoV-2.

Пример 6. Определение противовирусной активности экстрактов в отношении коронавируса SARS-Cov-2 в культурах клеток Vero Е6 и Vero.

Клеточные культуры. В работе использовали перевиваемые культуры клеток почки африканской зеленой мартышки Vero Е6 и Vero, полученные из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора. Монослой клеток выращивали в 96-луночных планшетах (по 0,1-0,15 мл/лунку клеточной суспензии с концентрацией 1,0-1,5×10⁵ кл./мл) в среде DMEM (ООО «БиолоТ», Россия) в присутствии 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота («Gibco», США) с добавлением пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и амфотерицина В (0,25 мкг/мл) (Antibiotic-Antimycotic (100Х), («Gibco», США) При культивировании клеток с вирусом в качестве поддерживающей среды использовали питательную среду DMEM с антибиотиками, без сыворотки.

Вирус SARS-CoV-2 штамм nCov/Victoria/1/2020 с инфекционным титром 5,0±0,29 (±0,57) lg ТЦД₅о/мл получен из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Концентрацию вируса определяли путем титрования в культуре клеток Vero Е6 или Vero при культивировании в течении 3 суток при 37°С, 5% С0₂ и влажности 85-90%. Титры вируса рассчитывали методом Спирмена-Кербера, выражали в десятичных логарифмах 50%-х тканевых цитопатических доз в мл (lg ТЦД₅о/мл) и представляли в виде М±т (±195) для 95%-го доверительного уровня (195) [Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика. 1976; 598 с; Virology Methods Manual. Edited by: Brian W.J. Mahy and Hillar O. Kangro. AcademicPress. 1996; 374 p.].

Колориметрический метод определения цитотоксичности и противовирусной активности препаратов in vitro.

Исследование цитотоксичности и противовирусной эффективности препаратов проводили колориметрическим методом - по изменению оптической плотности (ОП) раствора красителя, поглощенного живыми клетками в монослое [Oestereich L., Liidtke Α., Wurr S., Rieger Т., Munoz-Fontela C., Gimther S. Successful treatment of advanced Ebola virus infection with T-705 (favipiravir) in a small animal model // AntiviralResearch, 2014., 105: 17-21; Baker R.O., Bray M., Huggins J.W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections // Antiviral Research., 2003., 57:13-23; Paragas J., Whitehouse C.Α., Endy T.P., Bray M. A simple assay for determining antiviral activity against Crimean-Congo hemorrhagic fever virus // Antiviral Research. 2004, 62:21-25].

Для оценки эффективности каждого использовали 8 последовательных 3-кратных разведений препаратов. Начальная концентрация экстрактов на планшетах при оценке цитотоксичности и противовирусной активности препаратов составляла 300 мкг/мл.

При оценке противовирусной активности препаратов в лунки 96-луночных планшетов с монослоем клеток Vero Е6 или Vero вносили по 0,1 мл разведений экстрактов в среде DMEM (ООО «БиолоТ», Россия), а через 2 ч инкубации при 37°С, 5% CO₂ вносили по 0,1 мл разведения вируса в среде DMEM без сыворотки с множественностью инфицирования (MOI) 0,1 ТЦД₅₀/клетку. При такой множественности заражения цитопатическое действие вируса на монослой клеток через 3 суток инкубирования достигает не менее 90% (контроль вируса без внесения препарата). Кроме того, в качестве «контроля клеток» использовали интактный монослой (без внесения вируса и препаратов).

Через 3 суток инкубирования в лунки планшета с монослоем клеток Vero в культуральную среду вносили витальный (прижизненный) краситель нейтральный красный 0,05 мл на 1,5 часа при 37°С. После этого монослой клеток промывали двукратно физраствором, вносили лизирующий буфер и через 30 мин определяли оптическую плотность (ОП).

При использовании клеток Vero Е6 на монослой наносили 0,075 мл раствора МТТ (бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (Sigma, USA) в фосфатно-солевом буфере с концентрацией 1 мг/мл. Через 1,5 ч инкубации при 37°С краситель удаляли и клетки лизировали диметилсульфоксидом (ДМСО) и измеряли ОП.

Оптическую плотность измеряли с помощью планшетного ридера «Multiskan FC» (ThermoScientific, USA). Результаты измерения ОП в зависимости от концентрации препарата представлены в полулогарифмической системе координат (фиг.1). При этом по оси абсцисс (X) приведена концентрация препаратов в логарифмической шкале измерения, а по оси ординат (Y) - ОП в линейной шкале измерения. По показателям ОП рассчитывали 50%-ю токсическую концентрацию (ТС₅₀ в мкг/мл) и 50%-ю ингибирующую (эффективную) концентрацию (IC₅₀ в мкг/мл) препарата при помощи ПО SoftMaxPro-4.0. ТС₅₀ - это величина концентрации препарата в лунке планшета, разрушающая 50% клеток в монослое. IC₅₀ - это концентрация препарата, которая ингибирует репликацию вируса и сохраняет 50% клеток жизнеспособными.

На основании этих показателей рассчитывали индекс селективности (SI) препарата: SI=TC₅₀:IC₅o [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Хабриева Р.У. М: ОАО «Издательство «Медицина». 2005; 832 с.; Методические рекомендации по изучению специфической активности индукторов интерферонов. Руководство по проведению клинических исследований лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.].

Пример 7. Результаты определения противовирусной активности водных экстрактов чаги в отношении коронавируса SARS-Cov-2 на клетках Vero и Vero Еб.

В таблице 1 представлены результаты по оценке противовирусной активности водных экстрактов из чаги в отношении коронавируса, штамма nCov/Victoria/1/2020.

Как видно из таблицы 1 на коронавирусе образцы 20-15, 20-16, 20-17 проявили противовирусный эффект. На клетках Vero Е6, при одинаковой токсичности образцов индексы селективности SI равны 108,5; 81,1; 120,0 соответственно. На клетках Vero лучшим образцом был 20-17, индекс селективности у которого был равен 41,67, в то время как для образцов 20-15 и 20-16 SI в 2,49 и 2,32 раза меньше соответственно. Значение IC50 меньше всего было также у образца 20-17, как на клетках Vero Е6, так и на клетках Vero, и составляло 2,16-2,5 мкг/мл.

Таким образом, образец 20-17 может представлять вариант экстракта, который может быть получен даже в домашних условиях, без дополнительного измельчения аптечного природного сырья чаги в течение 3-х часов.

Образец 20-13 показал лучший результат на клетках Vero, как по значению IC₅₀=0,759 мкг /мл, ингибирующей 50% вируса, так и по индексу селективности, SI=155,5. Образец готовили выдерживанием водной суспензии чаги при 50°С в течение 48 часов. Именно такие рекомендации есть в работах ученых, которые первыми изучали чагу в СССР [Якимов П.А. Общая биологическая и химическая характеристика чаги как исходного сырья для получения препаратов // Чага и ее лечебное применение. Л. Изд-во мед. лит., 1959. - С. 36-49; Якимов П.А, Ступак М.Ф. Зольные элементы чаги и препараты из нее // Чага и ее лечебное применение. Л. Изд-во мед. лит., 1959. - С. 50-54]. Образцы, которые подвергались прогреванию дольше, не показали преимущества (72 часа при 50°С готовили образцы 20-15, 20-16). Слабую активность проявил Бефунгин, для получения которого проходит экстракция подогретой водой (68-72°С в трех реакторах, смешиванием с солями кобальта и спиртом) [Патент РФ №2548767, МПК А61К 36/06, опубл. 20.04.2015].

Лучшими образцами по ингибированию репликации коронавируса, штамм nCov/Victoria/1/2020, в клеточной культуре Vero являются образцы чаги в виде водных растворов, которые не подвергались длительному температурному воздействию. Это образец 20-13, водная суспензия которого прогревалась 48 часов при 50°С. А также образец 20-17, водная суспензия которого прогревалась на водяной бане при 95°С в течение 3-х часов.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к применению экстракта базидального гриба Inonotus obliquus для ингибирования репликации коронавируса SARS-CoV-2. Применение экстракта базидального гриба Inonotus obliquus, полученного водной экстракцией при температуре 50-95°С в течение от 1,0 до 72 часов, для ингибирования репликации коронавируса SARS-CoV-2, который при концентрации в диапазоне 0,75-11,6 мкг/мл проявляет 50%-ную противовирусную дозазависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточных культурах Vero Е6 и Vero. Вышеописанный экстракт эффективен для ингибирования репликации коронавируса SARS-CoV-2. 1 ил., 1 табл., 7 пр.

Применение экстракта базидального гриба Inonotus obliquus, полученного водной экстракцией при температуре 50-95°С в течение от 1,0 до 72 часов, для ингибирования репликации коронавируса SARS-CoV-2, который при концентрации в диапазоне 0,75-11,6 мкг/мл проявляет 50%-ную противовирусную дозазависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточных культурах Vero Е6 и Vero.