Способ получения метан-окисляющих бактерий Советский патент 1978 года по МПК C12K3/00 

Изобретение относится к технической микробиологии, а именно к вопросам микробиологического синтеза протеинов из метана, и касается способа получения метан-окисляющих бактерий, способных пере- вести метан в пищевой белок, Известен способ получения метан-окисляющих бактерий, согласно которому пробу почвы вносят в жидкую минеральную питательную среду, содержащую двухзамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний в количестве О,2 г/л и следы хлорного железа. Культивирование проводят Б присутствии смеси метана и воздуха, взятых, в соотнощении 1:1. Полученную культуру пересевают на минеральную агаровую среду с последующим культивированием и выделением бактериальной куль ТУРЫ l. Целью изобретения является упрощение процесса и получение бактериальной кул1 туры, обладающей высокой активностью, С этой целью согласно предлагаемому способу используют пробу почвы, выделенную из донного отложения пограничного биотопа, а в жидкую минеральную питательную среду (на 1 л) дополнительно вносят 1 мл раствора, приготовленного путем смешивания 18 л дистиллированной воды со следующими компоне(ггами, г: хлористый литий 0,5; пятиводный сульфат меди l.Oj семиводный сульфат цинка l.Oj борная кислота 11,0} сульфат аммония 1,0} гидрат хлористого олова шеетиводный сульфат никеля 1,О; четырехво; ный хлористый марганец 7,0} шестиводный нитрат кобальта 1,0} окись титана 1,0} йодистый калий 0,5 и бромистый калий 0,5. в ншдкую минеральную питательную среду и ведут процесс культивирования, среду смесью метана и воздуха, тых в отношении 1:1 (по объему). Для используемого донного осадка пограничного биотопа характерным является то, что в нем отсутствуют условия для процесса обмена веществ метан-окисляющего штамма бактерий в силу нехватки; кислорода в растворе минеральных пита тельных веществ. Для приготовления жидкой минеральной питательной среды используют из расчета на 1 л двухзамешенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний в количестве 0,2 г/л и следы хлорного железа, а также 1 мл раствора, содержащего на 18 п дистиллировашой воды следующие компоненты, г: хлористый литий 0,5; п$ггивод ный сульфат меди 1,0,« семиводный сульфат цинка 1,0} борная кислота 11,0|суль фат аммония 1,0; гидрат хлористого олова O,5i шестиводный сульфат никеля 1,0| четырехводный хлористый марганед 7,0} шестиводный нитрат кобальта 1,0| окись титана 1,0, йодистый калий 0,5 и бромистый калий 0,5. Полученную в результате культивиро вания культуру пересевают (переносят мааки) на пищевую среду-минерально-агаровутр и ведут последующее культивирование на ней. Затем выделяют единичные клетки из образовавшихся колоний и их культивируют на питательном растворе, состоящем из минеральных веществ в присутстеии смеси метана и воздуха в объемном отаощении 1:1. Послеэтого выделяют чистые культуры бактерий. Пример 1. Для выделения метан окисляющих бактерий берут 1 г пробы no4вы из донного отложения вблизи берега западного побережья Шензе, в местности расположения института лимнологии имени Макса Планка и вносят эту пробу в жид- кую минеральную питательную среду, описанную выше. Полученную смесь культивируют в ментере емкостью 200 мл при 27°С в газовой среде, состоящей из одной обьет ной части метана и одной объемной части воздуха. По истечении трех дней появилось на питательной среде плотное бактериальное разрастание, обнаруживаемое с помощью микроскопа,. Полученную культуру пересевают на минерально-агаровую среду и в течение пяти дней продолжают процесс культивирования в среде метана и воздуха, взятых в укашнном отношении, до образования на поверхн.ости видимых под микроскопом колоний. Из полученной популяции бактерий вы- деляют единичные клетки в капельках питательной среды. Их обрабатывают указанной смесью метана и воздуха. Спустя пять дней из находящихся в капельках гштательного раствора единичных клеток образовались чистые культуры бактерий (штамм М 102). Их выделяют известным образом. Установлено, что из 1 вес,ч. метана образовалось. 0,8-0,9 вес.ч. бактериальной культуры, Пример 2. Для получения характеристики культуры, полученной в примере 1| из соединений, приведенных в табл. 1, готовят субстраты в виде 1%-ных раствснров в минеральной питательной среде. Полученным субстратом прививают испытуемую культуру - штамм метан-окисЛяющих бактерий. Спустя 3,7 и 21 день с начала культивирования проводят испытания. Результаты приведены в таблнце. При этом обозначают знаками; никакого использования субстрата + слабое использование i весьма заметное использование.

Углеводы: глюкоза

фруктоза галактоза манноза рибоза

±

арабиноза

лактоза

мальтоза

сахаре за

крахмал

целлюлоза

Спирты:

метанол

этанол

пропенол

бутанол

изоамиловый

бензол

Альдегиды:

формальдегид

адетальдегид бензальдегид Жирные кислоты: муравьиная уксусная пропионовая

Аминокислоты: глицин

ЦИСТИН

аланнн фенилаланин

бычные субстраты: образование индола

Продолжение таблицы

±

+ +

+ +

+ f

проба на метилрот каталаза

окскаера

Me Conker Brotf.

(бульон)

лакмусовое молоко разжиженная желатина

Из приведенных в таблице данных вид UO, что из всех опробованных питательных сред подверглись значительному распаду (были использованы) жирные кислоты и ряд сред потреблялись слабо, в частности из спирто&-метанол. Это говорит о специфичности испытуемой культурытолько к одному виду, источника углерода метану.

Пример 3. Готовят растворы субстратов путем добавки органических соединений в концентрации 1% к жидкой минеральной питательной среде указанного типа;

В полученный раствор субстрата засевают испытуемую культуру штамм М-102 и культивируют при рН 7, температуре в ферментере при встряхивании.

Для сравнения эту же культуру засевают на аналогичную питательную среду, но без органических добавок, а культивирование ведут в присутствии смеси метана и воздуха, взятых в соотношении i:l.

Пробы отбирают спустя 3,5 и 7 дней. В результате было установлено, что испытуемый шТамм М-102 - специфичный в отношении метана.

Пример 4. Проводят испытания штамма М-1О2 на цветные пробы. Полученные результаты приведены ниже:

Проба (тест) Окрашивание:

по ГрамуОтрицательное

по кислотностиОтрицательное

спорОтрщхательное

жгутиковОтрицательное

капсулОтрицательное

Продолжение таблиць;

+ i+ +

Таким образом, можно сделать вывод,

что в испытуемой культуре отсутствуют акцепторы.

Пример 5. Определяют активност окисления метана штаммов . Для этого в ферментер емкостью 5 л вводят 1 л жидкой минеральной среды указанного типа и засевают испытуемую культуру культивируют при 27°С в присутствии смеси метанола и воздуха в отношении 1:1 по объему. Выход полученной через 5 дней культуры составил 1,5 г, что в пересчете на израсходованный метан составляет 0,8 вес.ч. культуры на 1 вес.ч. метана.

Пример 6. Засеянную по примеру 5 среду культивируют в ферментере екн костью 5 л при встряхивании при в присутствии смеси природного газа и воздуха в отношении 1:1 по объему.

Концентрация культуры, полученной через 5 дней, составила 1,5 г сухого ве шества.

Культуру отделяют от питательной среды и определяют ее состав. Установлено, что на 70% она состоит (по сухому веществу) из протеина, остальное - углеводы, липиды и составные части клеточных стенок.

Выход культуры в пересчете на метан составил 0,8 вес.ч. сухой массы бактерий из 1 вес.ч, природного газа. На дыхание израсходовано 2О% газа. Это соот- - ветствует наибольшему выходу, достигнутому когда-либо.

Пример 7. Опыт аналогичен примеру 6, но культивирование ведут в смеси метана к воздуха, состоящей из 59 об. воздуха и 41 об.% метана. В смеси.содержалось 11,8 о6.% кислорода (т.е.смес находится вне границ вэрьтоопасноста). При этом были предусмотрены все другие меры безопасности, предусмотренные при работе с газом в помещении {снабжение коммуникаций предохранительными клапана ми для избыточного давления, вынос фер ментера нз основного помещения в специальное, установка контрольных и сигнальных приборов и т. д.). Во время культивирования метан и воэ дух подают последовательно, точками с соблюдением интервалов, в зависимости, от выхода (при выходе 28 г/л относитель но сухого вещества биомассы продолжител ность подачи газа-4. мин, интервал выдерж ки-12 мин, Содержимое ферментера подвергают непрерывному диализу, удаляя замедляющие рост продукты. Выход биомассы составил 28 г/л nji- тательной среды. Приведенные примеры подтверждают эффективность получения метан-окисляющих бактерий по предлагаемому способу. Формула изобретения Способ получения мета№-окислшощшс бактерий, предусматривающий внесение пробы почвы в жидкую минеральную питательную среду, содержащую двухзамеще ный фосфорнокислый калий, сернокислый магний в количестве 0,2 г/л и следы хлорного железа, культивирование ее в присзггствии смеси метана и воздуха, вз1 тых в соотношении 1:1, пересев получая ной культуры на минерально-агаровую среду с последующим культивированием на этой смеси и выделением бактериальной культуры, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и полу чения бактериальной культуры, обладающей высокой активностью, используют почву, выделенную из донного отложения по граничного биотопа, -а в жидкую минеральную питательную среду дополнительно вно сят на 1 л питательной среды 1 мл раствора, содержащего на 18 л дистиллирова ной воды с 1едующие компоненты, г: хло ристый литий О,5, пятнводный сульфот меди 1,О, семиводный сульфат цинка 1,0, борную кислоту 11,0, сульфат аммония 1,0, гидрат хлористого олова О,5, щест водный сульфат никеля 1,О, четырехводный хлористый марганец 7,0, шестиводный нитрат кобальта 1,О, окись титана 1,О, йодистый калий 0,5 и бромистый калий О,5. Источники информации, принятые во Внимание 1фи экспертизе: 1. Микробиология , т. 38, вып. 2, 1969, с. 251-257.