Способ получения фосфолипазы Советский патент 1979 года по МПК C12D13/10 

1

Изобретение Относится к технике производства ферментов, в частности получения фосфолипазы, и может быть использовано в микробиологической промышленности.

Известен способ получения фосфолипазы путем культивирования микроорганизмов рода Bacillus на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением фермента из культуральной жидкости 1.

Этот известный способ является наиболее близким кпредложенному изобретению по технической сущности и достигаемому результату.

Выход фермента и его качество по известному способу недостаточно высоки, подготовка питательной среды для культивирования требует различных режимов стерилизации входящих в нее компонентов. Кроме того, основные компоненты питательной среды для кзльтивирования микроорганизмов рода Bacillus являются дефицитными и дорогостоящими, а их хранение связано с затруднениями, так как требует низких темнератур, что отражается на стоимости целевого продукта.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта и улучшение его качества.

Поставленная цель достигается тем, чтб в предлагаемом способе получения фосфолипазы из микроорганизмов рода Bacillus использзют штамм Bacillus subtilis G-22.

Способ осуществляют следующим образом.

Микроорганизмы штамма Bacillus subtilis G-22 культивируют на питательной среде, содержащей источники углерода, азота

и необходимые минеральные соли при следующем соотношении компонентов, г/л: ферментативный крахмал 170, кукурузный экстракт 11,4, пивн1 Ге дрожжи 2,3, лактоза 2,9, (NHi)2НРО48,4, NaCl 0,29, MgSO40,14,

K2S04 2,9, CaCls 1,1, ZnCla 0,14.

Стерилизацию компонентов питательной среды проводят при одном режиме стерилизации 20 мин при 1,2 атм и 123°С. В процессе культивирования осуществляю г аэрйцию при количестве подаваемого воздуха 0,17 мин, рН поддерживают в интервале 6,0-8,0 25%-ным раствором аммиачной воды или концентрированной фосфорной кислотой.

Затем фермент выделяют из кульГуральной жидкости.

Пример 1. Лабораторные опыты для получения фосфолипазы из бактерии рода Bacillus вида subtilis штамма G-22 проводят при последовательности операций: поддержка посевного материала в пробирках, культивирование Bacillus subtilis шт. G-22 в колбах.

Культуру Bacillus subtilis штамм G-22 поддерживают и консервируют на ломтиках картофеля в безкислородных средах: в про-бирках Ру, пробуждают в стерильных условиях. Из -пробирки вынимают резиновую пробку, ватную, смоченную пирогаллолом и гидроокисью калия и сухую ватную пробку, которую заменяют стерильной ватной пробкой. Затем культуру инкубируют при 37°С 24 часа.

После образования обильной пленки на картофеле культуру пересевают на свежий картофель в пробирках. Ру инкубируют при 24 часа.

Оживленную культуру освобождают от вегетативных форм, для чего подготавливают солевой раствор состава (на 1 л):

NaCl. 8,5 г

0,026 %-ный раствор CaCla10 мл

0,05%-ный раствор MgCla10 мл

Солевой раствор разливают в пробирки емкостью 18X180 мм по 5 мл и стерилизуют 20 мин при 1,2 атм и 123°С. Затем охлаждают до комнатной температуры и петлей переносят часть пленки с картофеля в стерильный солевой раствор (соблюдается стерильность).

Суспензию культуры в солевом растворе выдерживают в кипящей водяной бане 5 мин и после этого быстро охлаждают. После температурного шока, суспензию высевают на свежие ломтики картофеля. Выращивают 24 часа при 37°С. Пробирки хранят в холодильнике при +5°С или при комнатной температуре не более недели.

Подготовленную культуру используют в качестве инокулята при культивировании Bacillus subtilis штамма G-22 в колбах. Опыты проводят глубинным способом в аэробных условиях в Эрленмейеровских колбах объемом 100-700 мл, в которые помещают 20-120 мл питательной среды. Культивируют на питательной среде состава, г/л: ферментированный крахмал 170, кукурузный экстракт 11,4, пивные дрожжи 2,3, лактоза 2,9, (NH4)2HPO4 8,4, NaCl 0,29, MgSO4 0,14, K2SO4 2,9, CaCU 1,1, ZnCla 0,14.

Крахмал предварительно ферментируют (осахаривают) следующим образом: к 100 г крахмала приливают 200 мл воды и 20 мл раствора бактериальной амилазы с активностью 3 ед (АС)/мл (по колориметрическому методу). Суспензию тщательно размешивают, клейстеризуют в водяной бане при 75°С. Оклейстеризованный крахмал разжижают под влиянием бактериальной амилазы. Процесс ведут до образования эритродекстринов (красное окрашивание с йодом). Разжиженный крахмал охлаждают до комнатной температуры, смешивают с раствором остальных компонентов и доводят рН до 7,3 25%-ным водным раствором аммиака.

Готовую среду разливают в колбы и стерилизуют 20 мин при 1,2 атм и 123°С. После охлаждения до комнатной температуры осуществляют посев выше указанным инокулятом (соблюдается стерильность). Культивируют как в стационарных условиях,

так и при перемешивании на круговой качалке при 180 об/мин и 37°С. максимальное накопление фосфолипазы во всех случаях культивирования в колбах наблюдается от 15 до 35 часов. Продолжительное

культивирование (до 48-50 часов) приводит к сильному уменьшению или полной потере накопленной фосфолипазной активности. Биосинтез фосфолипазы происходит как в стационарных, так и в условиях перемешивания, с некоторым преимуществом во втором случае. Полученная активность равна 50,0 тромбопдастиновых ед/мл (по методу, описанному Otnaess А. В. и соавторов в журналах «Acta path microbiol. scand.

том В 80, стр. 373, 1972 г. и «Еиг. J. Biochem том 27, стр. 238, 1972 г.). Полученная наивысшая фосфолипазиая активность при культивировании в колбах равна 86,7 тромбопластиновых ед/мл.

Из проведенных опытов установлено, что продуцирование фосфолипазы бактериями Bacillus subtilis штамм G-22 происходит в широком температурном интервале - от до 50°С, с некоторым преимуществом

в интервале 37°С - 50°С (активность в среднем составляет 54,4 тромбопластиновых ед/мл) и в широком интервале рН - 5,0-9,0, с оптимумом при рН 7,5 (активность в среднем при рИ 7,5 составляет 86,4

тромбопластиновых ед/мл). При ферментации в колбах бактерии предлагаемого вида хорошо адаптируются к условиям культивирования, что связано со стабильностью (ио активности) получения фермента фосфолипазы. Из проведенных 86 ферментации в колбах среднее значение фосфолипазной активности составляет 60,0 тромбопластиновых ед/мл. Пример 2. Полупроизводственные

опыты для получения фосфолипазы из бактерии рода Bacillus вида subtilis штамма G-22 проводят при последовательности операций: поддержка посевного материала в пробирках, выращивание посевного материала в колбах, культивирование Bacillus subtilis штаМма G-66 в 20-л ферментерах. Поддержку культуры Bacillus subtilis штамма G-22 в пробирках в качестве инокулята проводят в соответствии с примером 1.-Культуру Bacillus subtilis штамма G-22 для засева ферментеров выращивают в зрленмейеровских колбах на среде, содержащей, г/л: ферментированный крахмал 170,0,

кукурузный экстракт 11,4, пивные дрожжи

2,3, лактоза 2,9, двузамещенный фосфат аммония 8,4, натрий хлористый 0,29, магний сернокислый 0,14, калий сернокислый 2,9, кальций хлористый 1,1, цинк хлористый 0,14.

Осахаривание крахмала проводят согласно примеру 1. Среду стерилизуют 20 минут при 1,2 атм, а затем охлаждают до комнатной температуры, рН среды доводят до 7,2-7,5 25%-ным водным раствором аммиака или концентрированной фосфорной кислотой.

Колбы с питательной средой при соблюдении стерильности засевают с помощью петли кусочком пленки из рабочей пробирки с культурой. Засеянные колбь культивируют в условиях перемешивания на круговой качалке при 180 об/мин и 37°С в течение 24 часов. Подготовленная культура Bacillus subtilis штамма G-22 служит в качестве инокулята для засева ферментера.

Культивирование проводят в 20-л ферментере при коэффициенте заполнения 0,5. Для выращивания культуры Bacillus subtilis штамма G-22 готовят питательную среду того же состава, как и в Эрленмейеровских колбах. Среду стерилизуют 20 минут при 1,2 атм и 123°С, рН среды после стерилизации доводят концентрированной фосфорной кислотой до 7,0-7,5.

Перед засевом питательную среду в ферментере продувают воздухом. После насыщения среды кислородом и установления температуры 37°С производят посев из расчета 200 мл микробной взвеси на 10 л среды. Культивирование проводят при 37°С и постоянной аэрации, при количестве подаваемого воздуха, равном 0,17 мин, рН во время ферментации поддерживают в интервале 6,0-8,0 путем добавления 25%-ного водного раствора аммиака или концентрированной фосфорной кислоты.

Максимальное накопление фосфолипаз наблюдается к 15-35 часам роста и составляет в среднем 97,0 тромбопластиновых ед./мл или 57,0 мг-экв/мл. мцн (по методу,

описанному Zwaal R. F. А. и соавторов в журнале «Biochim. et biophys. acta, том 233, с. 474, 1971).

Предлагаемый способ получения фосфолипазы по сравнению с известным техническим решением той же задачи позволяет повысить выход фермента примерно в пять раз, за счет чего снижается себестоимость продукции, с одновременным улучшением качества целевого продукта.

Способ обеспечивает производство стабильной фосфолипазы (по активности).

Формула изобретения

Способ получения фосфолипазы путем культивирования микроорганизмов рода Bacillus на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, отличаю щ и и с я тем, что, с целью повышения выхода целевого фермента и улучшения его качества, из микроорганизмов рода Bacillus используют штамм Bacillus subtilis G-22.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Журнал «Микробиология, т. 39, с. 465, 1970.