СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕТАНОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологической отработке ферментационных процессов, протекающих на жидких питательных средах с использованием углеводородов, в две стадии: получения посевной культуры и получения целевого продукта - биомассы метанокисляющих бактерий.

Изобретение может быть использовано в пищевой, медицинской, аграрной отраслях народного хозяйства и в исследовательской практике, в том числе в целях последующего масштабирования экспериментально отработанных технологических процессов.

Бактерии-метанотрофы по физиологическим и биохимическим свойствам представляют собой уникальную группу микроорганизмов, потребляющих метан природного газа в качестве источника углерода, что делает потенциальным использование биомассы бактерий для производства кормового белка.

Известен сайт: «Способы культивирования микроорганизмов», на котором опубликованы способы культивирования микроорганизмов. Высокая эффективность способов достигается оптимизацией питательных сред или селекционным отбором продуктивных штаммов бактерий, что может быть использовано в качестве обзорных аналогов к предлагаемому изобретению.

Известна публикация «Особенности биологии метанотрофньгх бактерий» (https://studexpo.ru/928906/…biologii-metanotrofnyh bakteriy), в которой дана характеристика метанотрофов, обладающих различными структурными, физиолого-биохимическими и генетическими особенностями.

Приведенные в этой публикации свойства: морфологическая изменчивость, секреция вторичных метаболитов и др., возникающие в определенных условиях культивирования бактерий в ферментерах, приводящие к вспениванию бактериальной суспензии, осаждению биомассы бактерий на стенках рабочей полости ферментеров и, как следствие к ингибированию роста, автолизу биомассы, снижают производительность и технологическую устойчивость ферментационных процессов.

Наиболее близким аналогом является «Способ каскадно-проточного культивирования микроорганизмов», патент RU 2193594 С1.

Известный способ осуществляется с использованием цепи ферментеров, в первом из которых выращивают посевную культуру бактерий методом порционного замещения части рабочей суспензии свежей питательной средой. Далее, вытесняемые из первого ферментера порции рабочей суспензии в каскадном протоке перемещают через цепь ферментеров в условиях полного замещения рабочей суспензии. Управление каскадным протоком осуществляют заданием времени культивирования в ферментерах и временной паузы между циклами каскадного протока.

Целевое назначение известного способа - применение в научно-исследовательской практике с использованием малых объемов культуральной жидкости (КЖ), что позволяет экономно использовать компоненты питательной среды, повысить качество синтезируемых продуктов и управляемость исследуемых процессов.

Недостатком известного способа является низкая производительность, значительная металлоемкость и перенасыщенность ферментерами и устройствами управления установкой, используемой для реализации способа, что приводит к образованию высокой цены ферментационного оборудования и сужает сферу применения способа в народном хозяйстве.

Технический результат заявленного изобретения состоит в оптимизации технологии проведения непрерывных процессов, повышающей устойчивость управления, производительность и применимость способа в народном хозяйстве при последующем масштабировании экспериментально отработанных процессов с использованием установленных количеств питательных веществ и минеральных солей в питательной среде для конкретных бактерий.

Указанная цель достигается тем, что способ культивирования метанокисляющих бактерий, осуществляемый в условиях каскадно-проточного культивирования микроорганизмов в ферментерах на жидкой питательной среде, обогащенной кислородом воздуха, отличается тем, что культивирование осуществляют на питательной среде, дополнительно обогащенной метаном и источниками азота, фосфора и минеральных солей следующего состава: калий азотнокислый, магний сернокислый, кальций хлористый, натрий фосфорнокислый однозамещенный, раствор микроэлементов, железо сернокислое, цинк сернокислый, медь сернокислая, марганец хлористый, кобальт хлористый, никель хлористый, натрий молибденовокислый, ЭДТК, а культивирование бактерий проводят при регуляции рН (7,0-6,5 ед.) в бактериальной суспензии одновременно в двух ферментерах - «посевном», работу которого осуществляют в условиях «объемно - доливного» процесса, доведенного до экспоненциальной фазы роста бактерий, при соотношении сливаемого объема к остаточному объему бактериальной суспензии в диапазоне (1,5-2,5):1, и в «маточном» ферментере, процесс в котором проводят до стационарной фазы роста бактерий, с периодическим порционным внесением в «маточный» ферментер бактериальной суспензии из «посевного» ферментера, при этом управление каскадным протоком осуществляют по заданному числу циклов подкисления бактериальной суспензии водным раствором ортофосфорной кислоты.

На рисунке показана блок-схема установки, позволяющая реализовать способ культивирования метанокисляющих бактерий. Согласно схеме, установка содержит емкость (1) с питательной средой, «посевной» (2) ферментер, патрубок (3) слива бактериальной суспензии по заданному уровню, «маточный» (4) ферментер, приемную емкость (5).

Эксперименты проводили в ферментерах, обеспечивающих заданные параметры перемешивания рабочей суспензии, аэрации, регулирования температуры и транспорта метана в рабочую жидкость, осуществляемого через стенку трубчатой газопроницаемой мембраны.

Характеристика используемых ферментеров: Рабочий объем «посевного» ферментера: 4,0 л. Рабочий объем «маточного» ферментера: 30 л.

Расход аэрирующего воздуха, продуваемого через «посевной» ферментер: 6 л/мин.

Расход аэрирующего воздуха продуваемого через «маточный» ферментер: 30 л/мин.

Давление метана в трубчатых мембранах: 0,9 кг/см².

Рабочая температура бактериальной суспензии в ферментерах: 32°С.

Объем единичной дозы 3%-й ортофосфорной кислоты: 0,2 мл.

Объем бактериальной суспензии, остающийся в «посевном» ферментере после отлива в «маточный» ферментер: 1,5 л.

Объем питательной среды, подаваемый в «посевной» ферментер после отлива избыточного объема бактериальной суспензии из «посевного» ферментера в «маточный» ферментер: 2,5 л.

Объем питательной среды, подаваемый в «маточный» ферментер после слива бактериальной суспензии в приемную емкость: 20 л.

Соотношение сливаемого объема к остаточному объему бактериальной суспензии составляет (1,5-2,5):1, однако экспериментальным путем для данной культуры было установлено оптимальное соотношение 2:1.

Размножение бактерий контролировали измерением оптической плотности бактериальной суспензии в отбираемых пробах с помощью прибора «Денситометр den - 1b».

В качестве биологического продуцента использовали изолят метанотрофной бактерии Methylomonas albus.

Питательную среду стерилизовали острым паром при 1 атм с выдержкой 30 мин. Питательная среда после стерилизации имела рН (6,5 ед.).

Для получения посевной культуры в колбу с отростком внесли 200 мл дистиллированной воды, в которую из 3-х пробирок смыли культуру метанотрофной бактерии Methylomonas albus, инкубированной на агаризованной питательной среде в течение 8 суток с двумя продувками метаном.

Культивирование бактерии Methylomonas albus в «посевном» и «маточном» ферментерах проводили на питательной среде следующего состава в (г/л):

Калий азотнокислый - 1,2; магний сернокислый - 0,2; кальций хлористый - 0,02; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,0; калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,0; раствор микроэлементов - 1 мл/л. Раствор микроэлементов в (мг/л): железо сернокислое - 2,0; цинк сернокислый - 0,1; медь сернокислая - 0,1; марганец хлористый - 0,03; кобальт хлористый - 0,2; никель хлористый - 0,02; натрий молибденовокислый - 0,03; ЭДТК -5,0.

Использование нитратной формы азота в питательной среде в процессе размножения бактерий приводило к подщелачиванию бактериальной суспензии, которое ограничивали значением рН 7,0 ед., что позволило обеспечить оптимальные условия протекания ферментативных реакций в продуцирующей культуре и поддержание заданной концентрации фосфатов в бактериальной суспензии.

В процессе культивирования бактерий, каждый раз, при значении рН (7,0 ед.), в «посевной» (2) ферментер вносили 3% раствор ортофосфорной кислоты, воздействием которой подкисляли бактериальную суспензию до исходного значения рН (6,5 ед.), и вели подсчет циклов восстановления рН до очередного подкисления.

Управление сливами бактериальной суспензии из «посевного» (2) и «маточного» (4) ферментеров осуществляли заданием числа циклов подкисления бактериальной суспензии.

Примеры реализации способа:

Пример 1. Реализация первой стадии культивирования бактерии Methylomonas albus в «посевном» ферментере. На приборе управления задали:

- верхнее значение рН в бактериальной суспензии - 7,0 ед.;

- число циклов подкисления рН в бактериальной суспензии - 5 циклов.

(В данном случае, 5 циклов подкисления рН в бактериальной суспензии соответствовали «экспоненциальной» фазе роста бактерий с ОД = 3 ед. оптической плотности).

Перед началом эксперимента, из емкости (1), в «посевной» (2) ферментер, внесли 4,0 л питательной среды, состава в (г/л):

Калий азотнокислый - 1,2; магний сернокислый - 0,2; кальций хлористый - 0,02; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,0; калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,0; раствор микроэлементов - 1 мл/л. Раствор микроэлементов в (мг/л): железо сернокислое - 2,0; цинк сернокислый - 0,1; медь сернокислая - 0,1; марганец хлористый - 0,03; кобальт хлористый - 0,2; никель хлористый - 0,02; натрий молибденовокислый - 0,03; ЭДТК - 5,0.

Питательную среду в «посевном» (2) ферментере засеяли культурой метанокисляющих бактерий и культивировали при температуре 32°С, при расходе аэрирующего воздуха 6 л/мин и давлении метана в трубчатой мембране 0,9 кг/см².

Процесс культивирования бактерий сопровождался подщелачиванием бактериальной суспензии до рН (7,0 ед.), при достижении значения которого в «посевной» ферментер (2), вносили 0,2 мл 3%-й ортофосфорной кислоты, воздействием которой бактериальную суспензию подкисляли до рН (6,5 ед.), и вели подсчет циклов подкисления рН в бактериальной суспензии.

Через каждые 5 циклов подкисления рН в бактериальной суспензии из «посевного» (2) ферментера через патрубок (3, в емкость (5) сливали 2,5 л бактериальной суспензии, а в «посевной» (2) ферментер из емкости (1) вносили 2,5 л питательной среды. Культивирование в указанных условиях проводили в течение 45 суток. В результате проведенного эксперимента выявлена общая устойчивость работы «посевного» (2) ферментера в условиях продолжительного «отьемно-доливного» процесса, высокая асептическая надежность процесса и эффективность управления по расходу ортофосфорной кислоты.

Пример 2. Реализация второй стадии культивирования бактерии Methylomonas albus в «посевном» и «маточном» ферментерах. На приборе управления задали:

- верхнее значение рН в бактериальной суспензии - 7 ед.;

- число циклов подкисления рН в бактериальной суспензии - 12 циклов.

(В данном случае, 12 циклов подкисления рН в бактериальной суспензии соответствовали «стационарной» фазе роста бактерий с ОД = 8 ед. оптической плотности).

Перед началом эксперимента сливной патрубок (3) «посевного» (2) ферментера, посредством трубопровода, соединили с «маточным» (4) ферментером.

Из емкости (1), в «маточный» (4) ферментер, внесли 20 л питательной среды того же состава, что и в примере 1.

Культивирование бактерии Methylomonas albus проводили одновременно в «посевном» и «маточном» ферментерах.

При каждом значении ОД = 3,0 ед. оптической плотности из «посевного» (2) ферментера, через патрубок (3), в «маточный» (4) ферментер, сливали 2,5 л бактериальной суспензии, и вели процесс культивирования бактерий в «маточном» (4) ферментере до стационарной фазы роста бактерий при температуре 32°С; расходе аэрирующего воздуха 30 л/мин; давлении метана в трубчатой мембране 0,9 кг/см², а в «посевном» (2) ферментере восстанавливали рабочий объем бактериальной суспензии внесением 2,5 л питательной среды из емкости (1) и продолжали процесс культивирования бактерий в «посевном» (2) ферментере до прохождения следующих 5 циклов дозирования 3%-й ортофосфорной кислоты в бактериальную суспензию.

Стационарная фаза роста бактерий в «маточном» (4) ферментере определялась прохождением 12 циклов подкисления рН в бактериальной суспензии, с контрольным измерением оптической плотности в отбираемых пробах, после чего производили полный слив бактериальной суспензии из «маточного» (4) ферментера в емкость (5). Слитую бактериальную суспензию передавали на стадию концентрирования и сушки биомассы, а в «маточный» (4) ферментер, из емкости (1), вносили очередные 20 л питательной среды и продолжали процесс культивирования бактерий до следующего слива.

Технический результат изобретения достигается в совмещении процесса получения активной посевной культуры метанокисляющих бактерий с процессом получения целевого продукта - биомассы бактерий, что позволяет существенно сократить время культивирования бактерий до стационарной фазы роста в «маточном» (4) ферментере и расширить сферу применения способа до внедрения в производство. Предлагаемый способ позволяет создать устойчивую, непрерывно работающую систему культивирования микроорганизмов за счет селективной минимизации вторичных метаболитов - побочных продуктов при культивировании в экспоненциальной фазе роста бактерий в «посевном» ферментере, а также повысить производительность совмещенного процесса за счет увеличения числа клеток в бактериальной суспензии, доведенной до стационарной фазы роста в «маточном» ферментере.

Поддержание рН (7,0-6,5 ед.) воздействием 3%-го раствора ортофосфорной кислоты обеспечило оптимальные условия протекания ферментативных реакций, управление концентрацией фосфатов в бактериальной суспензии, и исключило вспенивание бактериальной суспензии, обычно приводящее к осаждению биомассы бактерий на трубчатой мембране и рабочей поверхности ферментеров.

Процесс в «маточном» (4) ферментере осуществляют в условиях периодических добавок активной посевной культуры, снятой с экспоненциальной фазы роста «посевного» (2) ферментера, что интенсифицирует ферментативные реакции, протекающие в бактериальной суспензии, и, как следствие, повышает производительность маточного ферментера.

Приведенные в вышеописанных примерах значения содержания питательных веществ и минеральных солей являются оптимальными для данной культуры и обеспечивают ее нормальное развитие при отсутствии голодания в процессе культивирования и предотвращение попадания в готовый продукт количеств этих веществ и минеральных солей, превышающих допустимые.

Предложенный способ применим ко всем видам микроорганизмов, растущих в ферментерах на жидких питательных средах, по которым способ согласно изобретению обеспечивает экспериментальное установление оптимальных количеств питательных веществ и минеральных солей по каждой культуре, ориентируясь на приведенные в этих примерах величины.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ культивирования метанокисляющих бактерий предусматривает культивирование микроорганизмов в условиях каскадно-проточного культивирования в ферментерах на жидкой питательной среде, обогащенной кислородом воздуха и дополнительно обогащенной метаном и источниками азота, фосфора и минеральных солей, содержащей калий азотнокислый, магний сернокислый, кальций хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, железо сернокислое, цинк сернокислый, медь сернокислую, марганец хлористый, кобальт хлористый, никель хлористый, натрий молибденовокислый, этилендиаминтетрауксусную кислоту в заданных количествах, при регуляции рН 7,0-6,5 одновременно в двух ферментерах - посевном и в маточном. При этом работу посевного ферментера осуществляют в условиях отьемно-доливного процесса, доведенного до экспоненциальной фазы роста бактерий, при соотношении сливаемого объема к остаточному объему бактериальной суспензии в диапазоне (1,5-2,5):1. Работу маточного ферментера осуществляют до стационарной фазы роста бактерий с периодическим порционным внесением в маточный ферментер бактериальной суспензии из посевного ферментера. При этом управление каскадным протоком осуществляют по заданному числу циклов подкисления бактериальной суспензии 3%-ным водным раствором ортофосфорной кислоты. Изобретение позволяет оптимизировать технологию проведения непрерывных процессов, повысить устойчивость управления, производительность и применимость способа в народном хозяйстве при последующем масштабировании экспериментально отработанных процессов с использованием установленных количеств питательных веществ и минеральных солей в питательной среде для конкретных бактерий. 1 ил., 1 пр.

Способ культивирования метанокисляющих бактерий, осуществляемый в условиях каскадно-проточного культивирования микроорганизмов в ферментерах на жидкой питательной среде, насыщенной кислородом воздуха, отличающийся тем, что питательная среда дополнительно насыщена метаном и растворенными источниками азота, фосфора и минеральных солей следующего состава: калий азотнокислый - 1,2 г/л, магний сернокислый - 0,2 г/л, кальций хлористый - 0,02 г/л, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,0 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,0 г/л, железо сернокислое - 2,0 мг/л, цинк сернокислый - 0,1 мг/л, медь сернокислая - 0,1 мг/л, марганец хлористый - 0,03 мг/л, кобальт хлористый - 0,2 мг/л, никель хлористый - 0,02 мг/л, натрий молибденовокислый - 0,03 мг/л, этилендиаминтетрауксусная кислота - 5 мг/л, а культивирование бактерий проводят при регуляции рН 7,0-6,5 в бактериальной суспензии одновременно в двух ферментерах - посевном, работу которого осуществляют в условиях объемно-доливного процесса, доведенного до экспоненциальной фазы роста бактерий, при соотношении сливаемого объема к остаточному объему бактериальной суспензии в диапазоне 1,5-2,5 1, и в маточном ферментере, процесс в котором проводят до стационарной фазы роста бактерий, с периодическим порционным внесением в маточный ферментер бактериальной суспензии из посевного ферментера, при этом управление каскадным протоком осуществляют по заданному числу циклов подкисления бактериальной суспензии 3%-ным водным раствором ортофосфорной кислоты.