Способ получения биомассы микроорганизмов Советский патент 1978 года по МПК C12D13/06 

Изобретение относится к вопросам технической микробиологии, а именно к способам получения биомассы. Многие микроорганизмы обладают способцостью у1йлианровать углеводороды в качестве источника углерода и образов вать биомассу, представляющую собой одноклеточный белок или протеин, который может быть использован в качестве источ ника пищевых продуктов. Особый интерес представляют М1пфоорга1шалы, способные использовать газообразные органические соединения, содержащие в молекуле один или несколько углеродных атрмов, например метан. Известен способ получения биомассы микроорганизмов, согласно которому осуществляют культивирование в аэробных ус ловнях в присутствии газообразного мета на на жидкой питательной среде, содержащей источник азота н минеральные соли, метаниспользующего микроорганизма рода Methy Eoinonaa в присутствии, метанолиспользующего микроорганизма, относящегося к роду P$eu49«ottae. Однаковыход, получаемый при осуществлении известного способа нед таточно высок. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Цель достигается тем, что в качестве метаниспольэуюшего микроорганизма используют штамм М е 1 h у t о m О а Ч ST В№ 11О84,измикроорганиамоврода Peeudomonois используют штамм TeeucJolmonas N С1В 1112, при этом эти оба микроорганизма культивируют в при-. сутствии по меньшей мере одного из неметилотрофиых микроорганизмов, являющихся видовыми обрарпами poдaгвeudott(ottCfS а именно щтаммК-СГБ hfc 11О62, 11О63 или 11065, или рода MycobacteHium щтамм N CIB № 11061, которые спосо&ны метанизировать органические вешест-. ва, полученные метан-и/или метанолисполь эующими микроорганизмами. Согласно этому способу во время его осуществления поддерживают температуру 38-45 С. а рН б.4-.7,4.| Преимуществом этого способа, яроме повьлиениа выхода целевого продукта яв лается п&вышевве устойчивости к. внф幫 шшм и уменьшений пенообразованяа. Используемые микроорганизмы выделе вы из ПрЯрОДНШ ВСТОЧШЕКОВ источником азота жидкой митательноЙ. среды $1вляются аммиаК| мочевина, аммо нийные соли например сульфат, хлорид или нитрат, например нитрат щелочного металла. Кроме того, в ней содержатся источмвЦ ки фосфора, серы, магния и железа, ИстЬч НИКОМ фосфора служат фосфаты, например KgHPCJ, KHjPO -, та1н{Щ,1ЦП Епя фосфорная кислота, предпочтительно, в концентрацш 3-20 г/.ц, Источником серы может служить серная, кислота или сульфаты, например суль« фат аммония в кондентраций 0,5-5 г/л, Используется семиводный сульфат Mapi ния в конаентрании 0, г/п и шестиводное хлорное железо в коицентрации 0,,1 г/л, В среде могут содержаться следы дру гих элементов, например соли кальция, марганца, аигаса, кобальта, молибдена и бора Способ можно осуществлять периоде Чески и непрерывно. Среду, контактируют во врет-ш вЬ1ращивания микроорганизмов с газовой смесью содержащей метан и шюлород, В качествз яюточника метана можно использовать при родный газ. Непрерывный способ осуществляется в ферментере с лопастной мешалкой или в ферменте колонного типа с разбрызгива- нием, снабженном рубашкой охлаждения. Скорость iqjHTOKa среды при осущестiHjetfflH способа равна скорости отвода культуральной жидкости и составляет O,02i1,)0 объема культуры в час ГазВобразную смесь метана и кислоро аом Henpei BHO барботируют в питатель ную среду. Отработанный газ (выводят из верхней частИ} ферментера.. . Клетки микроорганизмов (биомассу) от бирают из питательной среды известнымиспособами, например седиментацией, осаждением с последующей фильтрацией. Псшученную биомассу сущат выморажи )ванием или распылительной сущкой. .ченную биомассу можно использовать в к тве источника белка, добавляемого в сорма животным или при приготовлении продуктов питания людей. Пример 1. Выделение культуры бактерий выращиваемых на-метане, Смещаннук культуру бактерий, растущих на метане, выделили из образца почвы IrpS аи), взятой натропической утиной ферме, и 2 г образна поместили в колб5 качалку на 250 мл с 25 мл среды09М« В среду подавали дважды в день газовую смесь, состоящую на 25% метана и 75% воздуха. Колбу инкубировали на ротащсонной качалке с орбитальным радиусом 2,5 см при 2ОО об/мин в течение 1 нед. Культуру, В которой появилась мутность, пересеяли, ваяв 2 ып инокулюма, в аналогичные кол-« бь -качалки в асептических условиях. Операшпо повторили несколько раз к по полу чеиии репродуцируемого роста культуры (ТЗ) из колб-«ачапок„использовали для инокуляции ферментера; . описанного в примере 5. Среда D ЭМ состоит из штамма MeikvEoVnonua Д CIB № И084, шта маРзеис ОШОКаб ГЧ CIB №11112 и штаммов PseudоJ O V ClB , 11063 иМусоЬас1ен{Ц№ VC3B № 11061. Пример 2. Микробиологические характеристики культуры ТЗ. В состав культуры входят следующие микроорганизмы: Метани пользующиЙ мшфоорганизм 6МЗ W № 11084 обладает нескользко изменчивой морфологией, имея вид коротких палочек, или кокковых палочек с внутренней мембранной (оболочковой) структурой, группированной параллельными складками в клетке. Этот микроорганизм растет в одиночестве на метане лишь медлешю. На основе приведенного вьше описания этот микроорганизм является ранее неописанным видом типаМеЬНуНощоПаб |cm №11084. Метанолис пользующий, микроорганизм, обозначенный ОМ U Я СШ Мз 11112, характеризуется способностью расти и образовать колонии лишь на агаровых пластинках, содержащих метанол в виде еди ственногЬ источника углерода. Рост не имеет места в присутствии глюкозы, лактозы, сахарозы, маннита, ионзита, цитрата или питательного агара. Микроорганизм около 2 мкм длиной и 1 мкм Ьгириной, с одним полярным жгутиком. Колонии на агаре однородные (гладкие, ровные и серые со сплощными краями (не прерываемыми) и появляются на агаровых пластинах с метаг олом/минеральными солями после 2 дней инкубации при 42°С. На ос новании описа1шого выше микроорганизм можно отнести к ранее неописанным вида типа Peeudomonas W ciB № 11112 Прочие типы микроорганизмов выделены из смеси, которая не может расти ни на метане, ни на метаноле, как единственном источнике углерода. Они получили обозначение М, Ма И Mj. Пни были подвергнуты дартным испытаниям или тестам для определения того, к каким микроорганизмам они относятся. Результаты этих тестов приведены в табл. 1 и 2. На основании приведенных результатов (полученных при указанных тестах) мож но сделать вывод об идентичных микроор ганизмах. Организм Mj является видом PseudomoitaB N ciB № 11062. Микроорганизм Mg является видом Mycobacler ium WCiB № lioei, микроорганизм Mg- видoмPвeuc}owoltas W CfB № 11O63, микроорганизм MA- видом Pseuclomortaie N CIB № noes. П p и M ep 3. Культуры выращйвали из семей .следующих бактерий: МЗ (растут лишь на метане) S ОМ (растут лишь на метаноле) (неметилотрофная бактерия) Приготовили питательную среду в сооП ветствии с описанным Шиханом и Джонсо ном (далее обозначаемая как среда IfiM содержащую следующие ингредиенты, г/л: 1.6 1 Н21-ид , 1,16 1,18 WaNO 0,О8 7Н 0,О14 РебОд Са O/O), 4Н20 О,025 , 8 X 10 С Ц 504. 6,8 10 KSO 6,0 MrtS04 4,8 10Na/ЛоО 2Н2О Культуру выращивали в стерильных ст лянных сосудах емкостью 500 мл, через которые непрерывно барботировали смесь мётана с воздухом. Аппаратура представляет серию сосуд через которые непрерывно через зинте1 зольяый фильтр барботировали смесь метана и воздуха в соотношении 1:3. Чере отверстия в сосудахосуществляют иноку лядию и отбор проб. Колбы ииокулировали 1,5 мл своей «ультуры (24-часивой) каждого из 4 ми 6 ста 06 роорганизмов, обозначенных М М,, М, {, /М, 1 к М, Вносили по 4 мл обоих метанисполь зующих (В МЗ) и метанолиспользуюших (ОМ 2 ) бактерий из 2-3 дневных культур, выращенных в колбах -качалках на среде Среда в сосудах представляла собой 40О мл среды tJ5M, описанной выше а рост определяли измерением оптической пло1;юсти (ОД) при длине волны 625 нм, Результаты приведены в табл. 3. Эти результаты показывают, что для обеспечения лучшего роста на метане необходима смешанная культура. Ситуация несколько улучшается в присутствии метанолис пользующих, но для лучшего роста необходимы все компоненты (смешанной культуры).. Эти результаты являются средними от трех экспериментов, из которых каждый повторяли два-три раза. Пример 4. Эти эксперименты имели целью проверить, можно ли заменить компоненты культуры ТЗ другими микроо{ ганизмами, обладающими аналогичными функциями. Культуры в барботируемых стеклянных сосудах те же, что и в примере 3, но в некоторых случаях метанолиспотшэующие микроорганизмы из культуры ТЗ заменяли метан олис пользукяцими микроорганизмами штамма NCIB № 1104О, Аналогичным образом неметилотрофическне компоненты ТЗ заменяли неметилотрофическими микроорганизмами MCIB № 11019, 11020, 11021, и 11022. Результаты приведены в табл. 4. Разница между цифровыми значениями в вертикальных колонках 6 в табл. 4 невелика. Можно поэтому заключить, что метанолиспользующие гушкросрганизмы NCtJB №11040 можно заменить OMU, Неметалотрофные компоненты взаимозаменяемы. Пример 5. Ферментация с испольрзованием культуры ТЗ. Культуру выращивали непрерывным способом на минеральной среде, метане и воздухе. Использовали при этом ферментер Биотек емкостью 2,5 л. Метан и воэдух распределяли в жидком содержимом из расчета 150 и 45О мл/мин cooTBeivственно. Температуру среды поддерживали около , а рН около 7,4. Среду перемешивали мещалкой со скоростью 1ООО об/мин. Давление в ферментере было чуть выше атмосферного. Используемая для непрерывного культивирования жидкая среда, обозначенная Stli, содержала: К11оР04, г/л1,6 г/л1,16 , WaMOg, г/л 3,18 0,107 Mg6Q )д 7 HI О, г/л 7 HjjO, г/л Са (MO),0, г/п Раствор микроэлементов, мл/л 1 Концентрированная, кислота, мл/л0,33 Дистиллированная вода, до л.1 Использованный раствор микроэлементов имел следующий состав, г/л: СиаОд SH-O3 «504 7Н200,336 MWe04 ,5 2Н,00,213 Этот общий раствор добавляли к ку среды в концентрации 1 мл/л, В ферментер внесли 2 л среды и кулья туру 1 М, перемешивали при аэрации и подавали метан. Мнокулировали 100 MJ: выращенной в колбе-качалке культуры ТЗ После обнаружения роста в ферментере д бавляли среду 5t).j из расчета 0,08 (степень разведения); Ееповышали на 0,02 ч с двухдневными интервалами до 0,22 ч без промывки культуры. Бы ли достигнуты равновесные состояния, при которых концентрация биомассы нахо далась в.интервале 2,5-6 г/л. Это, не высшая концентрация биомассы при непре рывном выращивании. Культуру выращивали непрерывно в течение более 3000 ч, Микроорганизмы собирали и анализировали результаты.. При любом состоянии равновесия и да ной степени разведения при непрерывном выращивании процент общей популяции ба терий, представленных любыми видами, не изменялся. Кроме того, культура очень ,устойчива к инфекциям чужими микроор Идентификаашя не использующи в смешанной культуре ТЗ. 61 0 ганиэмами, так что зар1:Йзнения нельзя было обнаружить даже при заражении культуры инородными микроорганизмами, Пример 6, Смешанную культуру метаниспользуюших бактерий выращивали непрерывным способом в ферментере емкостью ЗОО л в условиях, в основном эквивалентных указанным для ферментации в небольшом масштабе. Клетки собирали фугованием и сутшш методом распылител : ной cyuiKH, Получили рвободно-чгекущий без цвета и запаха порошок (SCP), соотояший из сухих бактериальных клеток с содержанием протеина 78%, Порошок испьн тывали на крысах следующим образом. SCP давали крысам отъемышам в течение 10 дней так, .что S СР представлял единственный источншс белков в диете. Каждый опыт контролировался контрольной диетой, в которой единственным HcT04tnncoM белков служил казеин. Для сравнения давали сель, дяную муку - один их богатейших белком видов кормовых добавок (для животных). Общее .содержание протеина ( М х 6,25) в каждой диете равно 10%, прочие питательные вещества давались в количествах, соответствующих оптимальному росту. Результаты экспериментов с питанием пpeдcтaвлeны в табл. 5, Из табл, 5 можно заметить, что 6СР, полученный из смешанной культуры бактерий, растущих на метане, является удовлетворительным видом белков. Несомненно он луще сельдяной муки в качестве диетического компонента при откор е животных. Аминокислотный спектр СР подвергали анализу, результаты приведены в табл. 6, Эти результаты указывают, что аминокислотный баланс таков, что позволяет признавать 5СР весьма подходящим в качестве протеинового корма для живо-Рных. Таблица 1 тан бактерий, содержащихся ы первой стадии

-+

ПалочкаПалочтса

-

-J--

помощи тголярного жгутика

Палочка

Палочка Использование глюкозы (креп.)Тест О - (Хуга и Лейфзона)Кислотостойкость

Идентификация не использующих метан бактерий, С15держащихся в смешанной культуре ТЗ, Вторая стадия испытаний (тестов) и VP (Вогеэ-Проскауэра)-. Глюкоза-Лактоза (кисл.)Сахароза (кисл.) Маннит (кисл.)-+. Мальтоза (кнсл.) Рост на питательном агаре++ Активность катала Восстановленле нитрата-Слабо

Таблица 2 (veou) --I -Окислитель Окисл ныйтельныйНестойкий - - - - - ,л (veoK) -. «, -ь + + лабо 61587012

Рост на метане после 3 дней при использовании раал1ячных сочетаний бактерий, содержащихся Б культуре ТЗ.

Микроорганизмы, содержащиеся в инокулуме

SM3 SM3, ОМЬ

5МЗ, МА, м, Мд, Мд

SM3, ОМЬ , М|, М, М Повышение оптической плотности (при 625 нм) различных

.смешанных купътур,: вырашиваемых на метане (средние значения 2 экспериментов, иа которых каждый повторяли четыре каждой культуры)

знак - обозначает отсутствует в культуре.

Таблица 3

Оптическая плотность через 3 дня

О,14 О,25 О,27 0,59

. Т а б л и ц а 4.

Таблица

13

Аминокислота

Аспарагинова

Треонин

Серии

Глутаминовая

Пролин

Глшшн

Алании

Валян

Цистин (1/2)

Метионин

Изолейдин

Лейцин

Тирозин

Феннлаланин

Аммиак

Омитик

Лизин

Гистидин

Аргинив

% М % м/м

Неочищенный Формула изобретен й 1. Снособ получения биомассы мшфо- организмов, предусматривающий культивирование в аэробных условиях в присутствин газообразного метана на жидкой пи тательной среде, содержащей источник аз1 та и минеральные соли, метаниспольаующего микроорганизма в присутствии мета нолиспользующего микроорганизма, относящегося к роду Peeudomo ttoie, о т личаюшийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве метаниспользующего микроорга

61587014

jjj a б n и ц a 6

% протеина

,48 4,00 3,30

0,ев

4Д8 4,63 6,16 5,91 О,31 2,78 4,50 7,02 3,51 4,37 2,О9 0,16 5,43 2,00 5,84 1,4 1,25 низма используют штамм Metll EoWOitaS fi № 11084, из микроорганизмов рсн;. да pseud О то RdS используют штамм PaeudomottoieN С1В № 11112, при этом последние культивируют в присутствии по меньшей мере одного иэ неметилотрофных микроорганизмов, предпочтительно штаммов Pseud ото на в W С|В № 11062,lPeeudomona5 МСЗВ № НОбЗ, PseudortfOKas NCIB №11065 Mjcobacle ium Ч С1В Мг 11601. 2. Способ по п. Ij о т л и ч а ю щи й, я тем, что температуру культивировеи1561587016

ния поддерживают в интервале 38-45 С.Источники информации) принятые.во

внимание при экспертизе:

с я тем, что рН регулируют в интервалеi.Патент Великобритании № 127ООО6,

e,,4.. С 6 f, 1972.