Способ дезагрегации почечной ткани Советский патент 1978 года по МПК C12K9/00 

Изобретение относится к области вирусологии. Известен способ дезагрегации почечной ткани, заключающийся в том, что в почки через сосуды органа вводят смесь 0,5%-ного раствора трипсина и О,04%-ноге раствора версена. Вы ход жизнеспособных клеток 90-120 млн Однако известный способ не обеспе чивает высокого выхода жизнеспособны клеток. Целью изобретения является повыше ние выхода жизнеспособных клеток. Эта цель достигается тем, что в качестве диспергирунняего раствора ис пользуют смесь 0,05-0,25%-ного раствора трипсина и 0,005 - 0,01%-ного раствора коллагеназы. Способ осуществляют следующим образом, У предварительно обескровленного 3-4-недельного поросенка асептически не повреждая капсулы, извлекают почки с участком б{жн11ной аорты в месте ответвления почечных артерий. Делают продольный разрез брнзшной аорты и в устье почечной артерии вставляют канюлю, через которую в сосудистую систему органа нагнетают дис пёргирующий раствор. В качестве .диспергирующего раствора : используют смесь 0,05%-ного раствора трипсина и 0,005%-ного раствора кoллarJнaзы. Растворы ферментов готовят на какойлибо питательной среде (0,5%-иый гидро.пизат лактальбумина, СМ КЬ - 1969) при рН 7,4. До введения 1испергирующего раствора сосудистую систему почки промывают 0,5 л раствора Дюльбекко без кальция и магния. Затем в почку нагнетают диспергирующий раствор. Через 10-12 мин прокачивания диспергирующего раствора почка размягчается и перфузию прекращают. Диспергирующий раствор удаляют, почку промывают 0,5%-ным гидролизатом лактальбумина с 20% сыворотки крупного рогатого скота. Затем в колбу с 150-200 мл питательной среды пинцетом слущивают корковое вещество перфузированной почки и колбу помещают на магнитную мешалку на 2-3 мин для получения гомогенного концентрата клеток. После фильтрации через мар.гао концентрат, минуя центрифугирование,разбавляют до нужной концентрации питательной средой с сывороткой рассевают в культуральные сосуды различной емкости.

Так как отсутствует измельчение ткани, центрифугирование клеток и разделение перфузированной ткани на изолированные клетки в гомогенизаторе то процент выхода живых сйстааляет 95-97%. Вследствие одновременного быстрого воздействия двух ферментов в пониженных концентрациях на все межклеточные связи клетки сохраняют морфологическую целостность наружных мембран, дают монослой на четвертые сутки и проявляют высокую чувствительность к вирусу ящура.

Применение предлагаемого способа позволяет осуществлять процесс дезагрегации клеток в мягких режимах, увеличить выход .клеток по сравнению с классическим способом (выход жизнеспособных клеток 400-420 млн из 1 г почечной ткани, что составляет 9095%, при классическом способе выход составляет 24-56 млн из 1 г почечной ткани) .

Предлагаемый способ позволит значительно упростить и сократить число операций, расходы рабочего времени, растворов, питательных сред, сыворюток, оборудования, животных - доноров.

Формула изобретения

Способ дезагрегации почечной ткани путем введения в почки -через сосуды органа диспергирующего раствора, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода жизнеспособных клеток, в качестве диспергирующего раствора используют смесь 0,05- 0,25%-ного раствора трипсина и 0,0050,01%-ного раствора коллагеназы.

Источники йнфО1 1ации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Авторское свидетельство СССР 340698, кл. С 12 К 9/00,.1972.