Способ криоконсервации эмбрионов кур Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

113

Изобретение относится к криобиологии, а именно к области низкотемпературного консервирования биологических объектов, в том числе с последующим их культивированием в искусственных условиях, и может быть использовано в ветеринарии, медицине и биологической промышленности.

Цель изобретения - повышение выхода и сохранности клеток, полученных из криоконсервированных птичьих эмбрионов и упрощение состава крио- защитной среды.

Пример 1. 10-дневные куриные эмбрионы из заведомо благополучного по инфекционным и инвазионным заболеваниям птицехозяйства просматривают на предмет определения жизнеспособности в овоскопе. В работе используют эмбрионы, проявляющие в овоскоп подвижность. Затем скорлупную оболочку дважды обрабатывают 5%-ной настойкой иода и со стороны путем с помощью обезвреженной инъекционной иглы делают прокол, направляя ее срезанный конец с внутренней стороны подскорлупной оболочки до среднего уровня длины яйца и отсасьшают 10 мл окружающей эмбрион жидкости. Эмбриональную жидкость удаляют и в полость вводят 10 мл диметилсульфо- ксида (ДМСО), то есть 20% по отношению к объему содержимого яйца с эмбрионом (50 мл). ДМСО предварительно перегоняют в вакууме, а перед вве- делием нагревают до 37°С. После извлечения иглы отверстие в скорлуп- ной оболочке заклеивают расплавленным на спиртовке стеклографом и куриные эмбрионы помещают на 35 мин при 37°С.

По истечении периода эквилибрации с криозащитной средой эмбрионы проверяют в овоскопе на предмет их жизнеспособности (в работу берут только подвижные эмбрионы). После нарушения целостности скорлупной оболочки эмбрион с помощью пинцета извлекают из яйца и помещают в стерильной полиэтиленовый контейнер (полиэтиленовые контейнеры после тщательной промывки в 9б -ном спирте-ректификате подвергают ультрафиолетовому облучению).

Контейнеры с эмбрионами перемещают в металлические пеналы и загружают в камеру аппарата для программного замораживания биологических объектов, где охлаждают от 10 до - 80 С со скоростью 0,3-0,5 с в минуту с

0

3572

последующим погружением биоматериала на хранение в жидкий азот. После хранения в жидком азоте контейнеры с эмбрионами перемещают для дефроста ции в водяную баню при . Затем в условиях стерильного бокса эмбрионы извлекают из контейнеров и помещают во флаконы с раствором Хэнкса (рН 7,2-7,4). После 2-кратного отмывания в растворе Хэнкса от туловища эмбриона отрезают голову, удаляют внутренности и измельчают ножницами до фрагментов величиной в 2-3 мм . Фрагменg ты ткани подвергают дезагрегации трипсином по общепринятой методике. В полученной взвеси определяют процент жизнеспособных клеток и далее их культивируют на питательной среде 199 с добавлением равного количества 0,5%-ного раствора гидролизата лактальбумина в растворе Хэнкса и 10%-ной сыворотки крови крупного рогатого скота. Результат: уровень жизf. неспособных клеток составил 87%, а выход живых клеток от одного эмбриона достиг 61 млн. По истечении 3 сут культивирования образовался монослой клеток.

Приме р 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением лишь того, что из эмбриона удаляют 2,5 мл омыващей его жидкости и вводят столько же ДМСО (5% по отношению к объему содержимого яйца). Ре5 зультат: уровень жизнеспособных клеток составил 15%, а выход живых клеток от одного эмбриона достиг 5 млн. По истечении 6 сут культивирования отмечалось прикрепление клеток, од нако формирования монослоя не произошло.

П р и м е р 3 . Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением лишь того, что из эмбриона уда ляют 5 мл омывающей его жидкости и вводят столько же ДМСО (10% по отношению к объему содержимого яйца). Результат: уровень жизнеспособных клеток составил 50%, а выход живых

0 клеток от одного эмбриона достиг 35 35 млн. По истечении 6 сут культивирования монослой образовался на 20% поверхности культурального сосуда.

5 Формула изобретения

Способ криоконсервации эмбрионов кур путем введения криопротектора в ткань эмбриона, отличающий- с я тем, что, с целью повышения

0

13A33 i7

выхода жизнеспособных клеток отколичестве 15-30% от объема внутреикаждого эмбриона, из полости яйцанего содержимого яйца и вводят такое

удаляют эмбриональную жидкость вже количество криопротектора.

Изобретение относится к криобиологии. Цель изобретения - повышение выхода жизнеспособных клеток от кАж- дого эмбриона. Из полости яйца удаляют эмбриональную жидкость в количестве 15-30 от объема внутреннего содержимого яйца и вводят такое же количество диметилсульфоксида. Перед введением препарат нагревают. (t. С ОС ос ОС СП