ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ГОНАД CAPRA HIRCUS L-ПРОДУЦЕНТ ВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1996 года по МПК C12N5/06 C12N7/00 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, биотехнологии и касается получения нового штамма культивируемых в монослое клеток гонад козы, который может быть использован для репродукции вирусов животных при проведении вирусологических исследований и изготовлении антигенов для диагностики и профилактики заболеваний животных указанной этиологии.

Перевиваемые монолинейные культуры клеток млекопитающих широко используются для проведения научных исследований (Новохатский А.С. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии. М. 1979, 156с.). Их получают из различных органов и тканей животных с помощью разнообразных методических приемов и подбора питательных сред для их культивирования (Дьяконов Л. П. Глухов В.Д. и др. Культивирование клеток и тканей животных. Учебно-метод.пособие. Ставрополь, 1986, I-II, 96с.).

Известно использование монолойных культур клеток ВНК-21, IB-RS-2, щитовидной железы телят, СП, СПЭВ, тестикулов поросят, ПСГК-30 и т.д. для культивирования вируса ящура, чумы свиней и т.д. (пат.Великобритании N 1436323, CM₆FA 5 B, 19.05.76, пат.Франции N 2088038, С 12 К 5/00, 07.01.72г, пат. Франции N 1526357, прототип С12 К, 16.04.68; Дегтяренко Н.Л. Савельева Л.Г. и др. Определение видовой принадлежности постоянной линии клеток ПСГК-30. Матер. межд. конф. "К новой стратегии борьбы с ящуром." Тез.докл. Владимир, 1991,с. 121-122.

Несмотря на их общее свойство способность к неограниченному росту все они значительно различаются по ряду других признаков: пролиферации, адгезионности, чувствительности к вирусам, способности размножаться в определенной питательной среде, антигенности, кариотипу, морфологии и др. Даже клоны одной перевиваемой линии клеток значительно отличаются друг от друга. Castro M.R. Pysany R.S. получили различные по чувствительности к вирусу ящура клоны клеточной линии IB-RS-2 (Castro M.R. Pysany R.S. Variation of cell clones derived from the IB-RS-2 suhue
cell line to the foot-and mouth disease virys. Arg. Inst. Biol. 1967,34,4 295-299).

Большая часть монослойных перевиваемых клеточных линий состоит из неоднородных в морфологическом и физиологическом отношении клеток, что обусловливает необходимость получения новых клеточных клонов с определенными свойствами.

Сущность изобретения.

В задачу создания настоящего изобретения входило расширение ассортимента новых штаммов культивируемых в монослое клеток животных, отличающихся от известных фено- и генетическими свойствами, стабильностью и пригодных для культивирования вирусов, используемых в НИР и для приготовления антигенов для диагностики и профилактики вирусных заболеваний животных.

Поставленная задача решена тем, что получен новы, ранее неизвестный штамм культивируемых клеток гонад козы (Caprahircus L.) СС-91 продуцент вирусов животных. Культура депонирована на 234 234 пассаже в монослое в ВСКК (СХЖ) РАСХН под N 45.

Характеристика полученного штамма
1. Родословная штамма
Штамм получен из первично-трипсинизированной ткани гонад 3-дневной козы путем последовательного пассирования на среде Игла с 10% сыворотки КРС и 0,03% глютамина. На промежуточных пассажах культура замораживалась до -196^oС с 5% этиленгликоля.

2. Число пассажей к моменту паспортизации
Штамм клеток на 234 пассаже в монослое.

3. Стандартные условия выращивания
Штамм клеток выращивается при температуре 36-38^oС в пристеночных условиях в сосудах различной емкости. Основной ростовой средой является среда Игла на солевом растворе Эрла или Хенкса с 10% сыворотки КРС и 0,03% глютамина. Возможно культивирование на среде с гидролизатом животных белков.

4. Культуральные свойства
Клетки формируют полный монослой с упорядоченной ориентацией на стекле культурального сосуда различного объема. Дезагрегацию клеток осуществляют с помощью смеси трипсин-версена (1:3) с добавлением 0,5% декстрозы. В зависимости от кратности рассева (1:2 1:4) и от посевной дозы (5-10)•10⁵ кл/мл время субкультивирования составляет 2-4 суток.

Ростовые характеристики клеток в монослое
Штамм выращивают в пристеночных условиях. При посевной концентрации (5-10)•10⁵ кл/мл монослой образуется на 2-3 сутки.

6. Цитоморфологическая характеристика
Монослой ровный, рост ориентированный. Клетки полигонального и фибробластоподобного типов с длинными цитоплазматическими выростами, преимущественно одноядерные; ядра округлой или овальной формы различной величины; число ядрышек 1-3, реже 4-7.

7. Кариологическая характеристика
Кариологический анализ штамма проведен на уровне 79 пассажа. Установлено, что кариотип соответствует видовому признаку козы. Модальный класс с 59 хромосомами составляет 42% диплоидные клетки составляют 8% гипоплоидные - 88% и гиперплоидные 4%
8. Видовая принадлежность
В процессе получения перевиваемого штамма видовую принадлежность контролировали методами кариологического анализа на 16, 37, 47, 76, 79, 186 и 253 пассажах и изоферментного (ЛДГ и Г6ФД) анализа на 47, 76, 186 и 253 пассажах. Во всех случаях штамм соответствовал виду коз.

9. Маркерные признаки и методы их оценки
Маркерные признаки не выявлены. Штамм по цитокариологии и спектру изоферментов относится к виду коз.

10. Характеристики контаминированности
При обследовании клеток штамма с 6 по 253 пассаж на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) контаминанты не выявлены (высевы на МПБ, МПА, ТГС и 0,3% PPLO агар, окрашивание акридиновым оранжевым и оливомицином, электронная микроскопия).

11. Биотехнологическая характеристики
Штамм выращивают при 37-38^oС в монослое в среде Игла на солевом растворе Эрла или Хенкса при рН 7,0-7,2 с добавлением 10% сыворотки КРС и 0,03% глютамина или на средах с гидролизатами белков животного происхождения. Клетки снимают со стекла подогретой до 37^oС смесью трипсин-версен (1:3) с 0,5% декстрозы, кратность рассева 1:2-1:4. Образование монослоя через 204 суток без смены среды. Жизнеспособность штамма клеток определяют суправитальной окраской трипановым синим и посевом в культуральный сосуд.

Определена чувствительность штамма CG-91 к заражению вирусами ящура, болезни Гамборо (БГ), болезни Ауески (БА) и африканской чумы лошадей (АЧЛ). Так, вирус ящура типов А, О, С и Азия-1 накапливается в монослойной культуре клеток CG-91 в титрах 6,0-6,5 ТЦД₅₀ /мл при титрировании в первично-трипсинизированной культуре СП (контроль-клетки CG-91). Штамм CG-91 может быть использован как тест-кульура для накопления, титрирования и изучения генетических признаков указанных вирусов, а также для изготовления из них антигенов для диагностики и профилактики заболеваний животных указанной этиологии.

12. Криоконсервационные характеристики
Штамм клеток сохраняют в жидком азоте под защитой криофилактика 5% этиленгликоля в ростовой среде с добавлением 10% сыворотки КРС, в стеклянных ампулах объемом 5 мл с концентрацией клеток 2,0-3,0•10⁶. Жизнеспособность после разморажевания 85-90%
Предложенный штамм культивируемых клеток гонад козы получили следующим образом.

Штамм культивируемых клеток гонад козы CG-91 получен путем трипсинизации ткани гонад 3-дневной козы. Органы извлекали с соблюдением правил асептической работы и помещали в стерильную чашку Петри с раствором Хенкса и антибиотиками пенициллином и стрептомицином по 500 ЕД/мл. В этом растворе органы держали при +4^oС 30 минут. После этого раствор Хенкса сливали, органы измельчали ножницами на кусочки размером 1-3 мм, затем дважды промывали вышеуказанным раствором и переносили в колбу для трипсинизации с 0,25% трипсина. Дезагрегацию ткани осуществляли на магнитной мешалке в течение 10-20 минут при комнатной температуре.

Надосадочную жидкость собрали в сосуд с небольшим количеством среды Игла с 20% сыворотки КРС для нейтрализации трипсина. Операцию дезагрегации повторяли 3-4 раза. Собранную суспензию фильтровали через два слоя стерильной марли и затем центрифугировали 5 мин. при 1000 об/мин. Осадок ресуспендировали в ростовой среде Игла с 5-10% сыворотки КРС и 0,03% глютамина и высевали в культуральные сосуды с концентрацией клеток (2-2,5)•10⁵ кл/мл среды. Монослой формировался на 4-5 сутки, клетки снимали со стекла смесью, содержащей 0,02% версена и 0,25% трипсина в соотношении 3:1 с добавлением 0,5% декстрозы. Кратность рассева 1:2, ростовая среда среда Игла с 10% сыворотки КРС и 0,03% глютамина.

Культура клеток гонад козы прошла 73 пассажа от момента первичной эксплуатации до превращения ее в перевиваемый штамм клеток. Как на низких пассажных уровнях субкультивирования (6-21), так и на более высоких (50-60) пролиферативная активность клеток была низкой: монослой формировался на 4-5-7 сутки, накопление клеток в культуральном сосуде (объем 1,5 л) не превышало 25-30 млн. Заметное увеличение пролиферативной активности наблюдали с 61 пассажа, однако формирование монослоя продолжалось не менее 4 суток культивирования. Выход клеток с одного матраса (V=1,5 л) составлял 40-50 млн.

Признаки перевиваемости установлены на 74 пассаже: резкое уменьшение размеров клеток, увеличение выхода клеток с матраса (90 млн), уменьшение срока формирования монослоя (72 часа) и увеличение кратности рассева (1:3-1: 4).

Штамм клеток сохраняют в жидком азоте под защитой криофилактика 5% этиленгликоля в ростовой среде с 10% сыворотки КРС в стеклянных ампулах объемом 5 мл. В клеточный банк ВНИИЗЖ заложены на 79-279 пассажных уровнях производственные партии предложенного штамма клеток под авторским названием CG-91, а также субкультура 12-70 пассажей. Размораживание клеток осуществляют путем оттаивания ампул с суспензией клеток в водяной бане при 37-38^oС. Жизнеспособность клеток определяют визуально под световым микроскопом, предварительно окрашивая их 0,01% трипановым синим. Жизнеспособность после размораживания 85-90% Свою исходную скорость роста клетки восстанавливают после 1-2 пассажей в монослое. Штамм клеток CG-91 депонирован в коллекции перевиваемых соматических клеток сельскохозяйственных и промысловых животных ВИЭВ (ВСКК СХ Ж РАСХН) под N 45.

Определена чувствительность клеток CG-91 к заражению вирусами ящура, БГ, БА и АЧЛ. Культуру клеток выращивали в монослое с 0,5% гидролизата лактальбумина или 0,25% ГБК, с 5% сыворотки КРС в объеме 50-500 мл.

Сведения, подтверждающие возможность осуществление изобретения
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами выращивания вирусов различных таксономических групп, что не ограничивает объем изобретения.

Пример 1. Выращивание вируса ящура А₂₂-663 в культуре клеток CG-91. Из культурального сосуда с клетками штамма CG-91 на уровне 40 пассажа удаляют среду культивирования. Монослой клеток дважды ополаскивают подогретой до 36-37^o смесью 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена (1:3) с добавлением 0,5% декстрозы, покачивают для орошения монослоя до начала отслаивания клеток (3-5 минут). Диспергирующий раствор сливают, вносят среду Игла с 10% сывороткой КРС и 0,03% глутамина и разливают в три аналогичных культуральных сосуда. Культура клеток 41 пассажа инкубируют при 37^oС в течение 48 часов до момента формирования плотного монослоя.

Перед внесением вируса питательную среду из культуральных сосудов сливают, клетки отмывают раствором Эрла и вводят вируссодержащий материал множественностью 0,01-0,1 ТЦД₅₀клетка или 1:30-1:50 к объему культуральной среды в сосуде.

Контакт осуществляют при 37^oС в течение 1 часа. Затем монослой отмывают раствором Эрла для удаления неадсорбировавшегося вируса, заливают в сосуды Игла без сыворотки рН 7,5 и инкубируют при 37^oС в течение 24-48 часов до полного лизиса инфицированной вирусом культуры клеток.

Инкубирование прекращают, материал дважды замораживают при -40^oС и оттаивают при +37+38^oС для освобождения внутриклеточного вируса определяют титр вируса в культуре клеток перевиваемой почки свиньи. Титр равен 6,0±0,5 lg ТЦД₅₀/мл. Чувствительность к вирусу ящура А₂₂663 у штамма клеток CG-91 находилась на этом уровне от 40 до 190 пассажей.

Пример 2. Выращивание вируса ящура 0₁-194 в культуре клеток CG-91.

Монослой клеток CG-91 получают так, как описано в примере 1. Вирус ящура 0₁-194 выращивают, собирают и титрируют в полученной культуре клеток так, как описано в примере 1. Вирус ящура 0₁194 получают с титром 5,75±0,25 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 3. Выращивание вируса ящура С₁- 564 в культуре клеток CG - 91.

Для репродукции вируса монослой клеток CG 91 готовят так, как описано в примере 1. Вирус ящура С#-564 выращивают, собирают и титрируют так, как описано в примере 1. Вирус ящура С₁-564 получают с титром 6,0±0,25 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 4. Выращивание вируса ящура Азия-1-48 в культуре клеток CG-91.

Для репродукции вируса монослой клеток CG 91 готовят так, как описано в примере 1. Вирус ящура Азия-1-48 выращивают, собирают и титрируют так, как описано в примере 1. Вирус ящура Азия-1-48 получают с титром 5,75±0,25 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 5. Выращивание вируса БГ в культуре клеток CG-91.

Для репродукции используют вирулентный штамм 52/70 или аттенуированный шт. "Ухтинский" вируса БГ 1 пассажа на 9-10 дневных куриных эмбрионах или первично-трипсинизированной культуре клеток куриных эмбрионов.

Культуру клеток гонад козы готовят так, как описано в примере 1. Вирус выращивают при 37^oС. Сбор вируса производят через 72 часа после заражения культуры клеток (при лизисе 50-75% клеток монослоя). Клеточную культуру дважды замораживают при -40^oС и оттаивают при +37^oС для увеличения выхода внутриклеточного вируса в поддерживающую среду и определяют титр вируса по лизису монослоя клеток перевиваемой культуры клеток почек свиньи ПСГК или кролика RK-13. Титр вируса равен 5,00±0,25 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 6. Выращивание вируса БА в культуре клеток CG-91.

Для выращивания используют вирус БА штамм 18 В. Культуру клеток гонад козы готовят так, как описано в примере 1. Культивирование вируса ведут в течение 36-48 часов до максимального проявления цитолитического воздействия вируса в монослое клеток. Сбор вируса и определение титра приводят так, как описано в примере 1. Титр вируса равен 8,25±0,25 lg ТЦД₅₀/мл. При культивировании в других системах вирус БА имел титр на клетках линии почки свиньи ПСГК 7,2 lg ТЦД₅₀/мл, IB-RC-2-6,4 lg ТЦД₅₀/мл и СП- 7,6 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 7. Выращивание вируса ящура А₂₂-663 в культуре клеток CG-91 с использованием поддерживающей среды на основе гидролизатов белков животного происхождения.

Монослой клеток CG-91 40-190 пассажей получают так, как описано в примере 1. Клетки инфицируют вирусом ящура А₂₂-663 в дозе 0,01-0,1 ТЦД₅₀/мл или 1:30 1:50 объема среды. Контакт осуществляют в течение 1 часа при 37^oС, затем монослой отмывают раствором Эрла для удаления неадсорбировавшегося вируса. В качестве поддерживающей среды используют культуральную среду на основе гидролизатов белков молока (0,5% ГЛА) или белков мышц КРС (0,25% ФМГ-С), или белков крови КРС (0,25% ФГБК-с) Культивирование, сбор и титрирование вируса ящура ведут так, как описано в примере 1. Вирус ящура А₂₂-663 получают с титром 5,75±0,25 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 8. Выращивание вируса ящура 0₁-194 в культкультуре клеток GG-91 CG-91 с использованием поддерживающей среды на основе гидролизатов белков животного происхождения.

Монослой клеток CG-91 получают так, как описано в примере 1. Вирус ящура 0₁-194 выращивают, собирают и титрируют в полученной культуре клеток так, как описано в примере 7. Вирус ящура 0₁-194 получают с титром 5,5-5,75 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 9. Выращивание вируса ящура С₁-564 в культуре клеток CG-91 с использованием поддерживающей среды на основе гидролизатов белков животного происхождения.

Монослой клеток CG-91 получают так, как описано в примере 1. Вирус ящура С₁-564 выращивают, собирают и титрируют в полученной культуре клеток так, как описано в примере 7. Вирус ящура С₁-564 получают с титром 5,75-6,0 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 10. Выращивание вируса ящура Азия-1-48 в культуре клеток С-91 с использованием поддерживающей среды на основе гидролизатов белков животного происхождения.

Монослой клеток CG-91 получают так, как описано в примере 1. Вирус ящура Азия-1-48 выращивают, собирают и титрируют в полученной культуре клеток так, как описано в примере 7. Вирус ящура Азия-1-48 получают с титром 5,5-6,0 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 11. Выращивание вируса БГ "шт.Ухтинский" в культуре клеток CG-91 с использованием поддерживающей среды на основе гидролизатов белков животного происхождения.

Монослой клеток CG-91 получают так, как описано в примере 1. Вирус БГ выращивают собирают и титрируют так, как описано в примере 5. В качестве поддерживающей среды используют культуральную среду на основе гидролизатов белков молока (0,5% ГЛА) или белков мышц КРС (0,25% ФМГ-с) или белков крови КРС (0,25% ФГБК-с).

Вирус БГ получают с титром 5,25±0,25 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 12. Выращивание вируса БА штамм 18В в культуре клеток CG-91 с использованием поддерживающей среды на основе гидролизатов белков животного происхождения.

Монослой клеток CG-91 получают так, как описано в примере 1. Вирус БА выращивают, собирают и титрируют так, как описано в примере 6. В качестве поддерживающей среды используют культуральную среду на основе гидролизатов белков молока (0,5% ГЛА) или белков мышц КРС (0,25% ФМГ-С) или белков крови КРС (0,25% ФГБК-с). Вирус БА получают с титром 8,0±0,25 lg ТЦД₅₀/мл.

Проведены исследования по определению пролиферативной активности клеток CG-91. Результаты приведены в таблице 1.

В процессе непрерывного пассирования неоднократно проводили описание морфологических особенностей культуры клеток CG-91 и подтверждение ее видовой принадлежности путем кариотипирования и определения изоферментной активности (ЛДГ и Г6ФД). Результаты исследований приведены в таблице 2.

Проведены исследования по определению чувствительности культуры клеток к заражению вирусом ящура различных типов. Результаты исследований приведены в таблице 3.

Результаты, приведенные в табл.3, показывают, что чувствительность к вирусу у линии клеток на уровне 40-189 пассажей не изменяется и не имеет штаммовых различий у А₂₂-663, С₁-564, Азия₁-48. Накопление вируса О₁-194 было несколько ниже.

Репродукционные свойства вируса ящура изучены также в течение 10 последовательных пассажей в монослое линии клеток CG-91. При этом установлено, что в клетках 160-170 пассажей вирус ящура А₂₂-663, 0₁-194, С₁-594 и Азия₁-48 на протяжении 10 пассажей репродуцировался в титрах 5,0-6,5 lg ТЦД₅₀/мл.

Проведен также ряд опытов по определению чувствительности к вирусу ящура линии клеток CG 91 в сравнении с клетками СПЭВ, FLK, ПС при титрировании в них вируссодержащих культуральных материалов, где получены данные, что клетки CG-91 имеют чувствительность на 0,75-1,0 lg ТЦД выше.

Проведены иследования по культивированию вируса БГ в различных системах культивирования при этом установлено, что титры вируса БГ в культуре клеток CG-91 на 1-2 логарифма ниже результатов репродукции вируса БГ в клетках ПСГК, RK-13, ККЭ и на куриных эмбрионах, что указывает на видовые отличия клеточных культур и необходимость изучения качества репродуцированного вируса. Накопление вируса БГ в клетках CG-91 составляло 4,25-5,0 lg ТЦД₅₀/мл и зависело от плотности монослоя клеточной кульутры, множественности инфицирования и биологических свойств культурального вируса.

Проведены исследования по определению чувствительности культуры клеток CG-91 к заражению вирусом БА штамм 18В. Оценку чувствительности осуществляли паралельным титрированием вируса БА штамм 18В в культурах клеток ПСГК, IB-RC-2, СП и CG-91. Результаты опытов приведены в табл.4.

Данные табл. 4 свидетельствуют о том, что клетки CG-91 обладают более высокой чувствительностью к заражению вирусом БА по сравнению с клетками ПСГК, IB-RS-2 и СП.

Вирус БА хорошо репродуцировался в монослое клеток CG-91, где на 1-3 пассажах имел инфекционную активность 7,0-7,5 lg ТЦД₅₀/мл.

Таким образом, при испытании чувствительности линии клеток CG-91 установлена видовая особенность культуры репродуцировать вирус БА в более высоких титрах, чем вирусы ящура и БГ, что определяет ее пригодность для титрования и получения вирусного антигена.

Результаты сравнительных исследований по репродукции вирусов ящура, БГ и БА в культуре CG-91 с использованием различных поддерживающих сред представлены в табл.5.

Таким образом, штамм клеток гонад козы CG-91 может быть использован для репродукции вирусов животных при проведении вирусологических исследований и изготовлении антигенов для диагностики и профилактики вирусных заболеваний животных. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4

Использование: вирусология, ветеринария, биотехнология. Сущность изобретения: штамм монослойных клеток CG-91 (авторское наименование) получен из первично-трипсинизированной ткани гонад 3-дневной козы путем последовательного пассирования на полусинтетических питательных средах, обладает стабильными морфофизиологическими характеристиками и чувствительностью к заражению вирусами ящура А₂₂-663, О₁-194, С₁-154, Азия-1-48, БГ, БА и АЧЛ, репродуцирует их при культивировании в монослое в титрах 5,0-8,25 lg ТЦД₅₀/мл, хранится в музее клеток ВНИИЗЖ и депонирован на 234 пассаже в монослое в ВСКК (СХЖ) РАСХН под N 45. 5 табл.

Штамм культивируемых клеток гонад Capra hircus L ВСКК(СХЖ) РАСХН N 45 продуцент вирусов животных.