Способ приготовления туляремийной вакцины Советский патент 1946 года по МПК A61K39/00 

Известен способ Кудо {/ар. lourn Exper. Med т. ХИ. вып. 1, стр. 377-394, 1934) приготовотения авирулентной живой туляремпйной вакцины, которая неспособна размножаться в организме, и поэтому эффективность ее низка и почти равняется эффективности убитой туляремийной вакцины. Этим объясняется то, что «вакцина Кудо не получила практического применения.

Предлагаемый способ приготов;1ения слабовирулентноГ живой туляремийной вакцины, которая в органических масштабах размножается в тканях и по механизму действия может быть уподоблена самой эффективной из всех вакциноспенной, также слабовирулентной (аттенуированной), а не авирулентной вакцине.

Способ получения производственных вакцинальных штаммов заключается в том, что на ряд пробирок с желточной средой высеивается вирулентная туляремийная культура. Пробирки ставятся в термостат при температуре 37 и сохраняются без предохранения от высыхания. Время от времени отсюда делаются высевы на свежую желточную среду. Последний штам.м, полученный при длительном высушивании, снова засеивается на ряд пробирок и процедура повторяется снова. Процесс получения вакцинальных штаммов д.чится около 7-12 месяцев. Полученные ослабленные штаммы испытываются на иммуногенность на белых мышах.

Через месяц вакцинированные животиые идут г.пыт контро.чьного заражения 1000 минимальных смертельных доз вирулентно ту тремийной культуры. В этом опыте определяется минимальная вакцинирующая доза, характеризующая иммуногенные качества данного штамма. Второй способ оценки иммуногенности полученных аттенулированных штаммоЬ- определение минимальной приживающей дозы. Для этого ряду мйшей вводятся под кожу различные разведения с различным содер йамяем микробов данного штамма. Через 5 дней мышей убивают и . Из всех органов делаются посевы на среду .Мэк-Коя. Мини№ 66621- -

мальное количество микробов, которое способно приживаться в организме животного и дать специфический рост на среде Мэк-Коя из органов мыши, поотучившей это количество микробов, будет минимальной приживающей дозой, характеризующей иммуногенные достоинства штамма.

Пример приготовления и контроля жидкой живой туляремийной I. Посевы культуры для изготовления вакцины

Для изготовления туляремийной живой вакцины применяется однодвухсуточная культура производственного туляремийного штамма на желточной среде Мэк-Коя или цистиновом агаре с рыбным гидролиза10М. Цистмновый агар необходимо выдержать после 2-3-суточной проверки па стерильность в термостате при температуре 37 не менее двух недель, а при комнатной температуре- от двух до трех недель. Среды - желточная пли цистиповый агар-разливаются в флаконы или матрацы емкостью 100 см

Перед посевом культуры конденсационная жидкость с соблюдением асептики отсасывается из флаконов и матрацев. Посев может производиться платиновой петлей густыми штрихами или закапыванием пипеткой маточной эмульсии со стандартом 8--16 млрд, микробных тел. При посеве закапыванием эмульсия путем легкого покачивания распределяется равномерным тонким слоем по всей поверхности питательной среды в матрацах или флаконах и они отставляются в горизонтальном г оложении около 30 мин, после чего могут переведены в вертикальное положение, но и могут быть оставлены в горизонтальном на все время нахождения в термостате.

В зависи.мости от интенсивности роста посевы выдерживаются в термостате от 24 до 48 час при температуре 37. Термостаты должны быть проверены и отрегулированы на температуру 37, так как повышение температуры выше 37 может дать задержку роста шта.мма, изменение его свойства и гибель, наступающую при температуре 40.

Маточная туляремийная эмульсия перед производственным, посевом микроскопируется и испытывается в реакции агглютинации на стекле с разведенной 1:10 агглютинирующей туляремийной сывороткой. Рост культуры на желточной среде Мэк-Коя смывается незначительным количеством стерильного физиологического раствора (1-1,5 см раствора для смывания роста культуры с флакона со средой). Смыв отсасывается стерильно в пробирку. Можно в одну и ту же пробирку отсосать смыв из нескольких флаконов указанной выше емкости. Остатки маточной эмульсии в пробирке после производственного посева для контроля €2 стерильности и условий производства засеваются на слабощелочной бульон, косой агар, полужидкий агар в количестве одной-двух капель на пробирку. Контрольные посевы помещаются в термостат. Через двое суток делается пересев с жидких сред на свежие жидкие.

П. Приготовление вакционной эмульсии

Рост туляремийной культуры на желточной среде Мэк-Коя или цистиновом агаре после 24-48 час пребывания в термостате при температуре 37 смывается физиологическим раствором. Равномерным покачиванием флаконов или матрацев рост туляремийной культуры эмульгируется в смывающей жидкости, а затем она пастеровской пипеткой илк сифоном отх;асывается в стерильную пробирку или колбу. Нативная эмульсия микроскопируется для определения чистоты бактериально

вакцины

взвеси, ставится реакция агглютинации с агглютинирующей туляремийной сывороткой в разведении 1:10 на стекле и сеется на слабощелочной бульон, косой агар, полужидкий агар и среду Мэк-Коя. Далее определяется стандарт нативной эмульсии по стандарту ЦГНКИ для ми:кробов кишечной группы. При получении типичных для туляремийной культуры результатов, нативная эмульсия употребляется для изготов тения туляремийной вакцины.

П. Приготовление жидкой туляремийной вакцины

24-48-часовая туляремийная культура на среде Мэк-Коя или цистиновом агаре смывается стерильным физиологическим раствором, смыв отсасывается, в зависимости от количества нативной эмульсии, пастеровской пипеткой в пробирку или сифоном в стерильную колбу. Затем нативную эмульсию микроскопируют, стандартизируют и ставят реакцию агглютинации с туляремийной агглютинирующей сывороткой. Кроме того делается посев нативной эмульсии на обычные питательные среды (слабощелочной бульон, косой агар, полужидкий агар) и среду Мэк-Коя. После определения стандарта нативной эмульсии и получения результатов микроскопирования и реакции агглютинации на стекле приступают к приготовлению жидкой туляремийной вакцины. Нативпая туляремийная эмульсия разводится стерильным физиологическим раствором до стандарта 50 млн. микробных тел 1 см (для взрослых) и до 10 млн. в I см (детская вакцина) и разливается по 25-50 см в стерильные ампулы нейтрального стекла. Запайка ампул производится вслед за разливкой или разлитая продукция, закрытая ватными пробками, выносится в запаячную для запайки. Бактериологический контроль разведенной вакцины производится посевом ее на обычные питательные среды и среду Мэк-Коя:

1)непосредственно вслед за разведением вакцины и

2)в процессе разливки вакцины (в начале, середине и конце разливки).

Через 3 дня после разливки делается посев из нескольких ампул (2-3).

Жидкая вакцина в ампулах подвергается физическому контролю на присутствие микроскопических примесей (ваты, стекла, песка, пригари от запайки и т. д. ). Ампулы, содержащие посторонние примеси, бракуются.

Контроль на безвредность. Для контроля на безвредность пользуются морскими свинками, которым вводят подкожно 4-5 см готовой жидкой вакцины. В случае гибели животных производится патолого-анатомическое вскрытие для установления причины гибели. Опыт повторяется.

Контроль иммуногенных свойств. Для контроля иммуногенных свойств проводят однократную вакцинацию готовой жидкой вакциной белых мыщей или морских свинок с последующим заражением иммунизированных животных 1000 минимальных смертельных доз живой вирулентной туляремийной культуры (порядок работы изложен выще). Жидкая туляремийная вакцина хранится в сухом, темном месте на льду при температуре О-2. При этих условиях срок годности ее 20 дней. Вакцина пересылается в термосах, куда закладывается лёд с поваренной солью.

Работа в лаборатории по производству живой туляремийной вакцины производится по общей бактериологической и производственной методикам без коррективов, вводимых в методику режимом противочумных и туляремийных учреждений. Режим работы и условия произ№ 66621

№ 66621 - 4 -

гюдства (помещение, внутренний распорядок) соответствуют тем требованиям, которые предъявляются к лаборатории, выпускаюишм живые вакцины ЕВ и БЦЖ.

Пример приготовления сухой живой туляремийной вакцины

Нативная эмульсия готовится так же, как и для жидкой вакцины, только смыв делается не физиологическим раствором, а 5%-ным раствором желатины. Бактериологический контроль нативной эмульсии на загрязнение посторонними микроорганизмами производится вначале, середине и конце разливки ее в ампулы посевом одной-двух капель эмульсии на обычные прнменяющиеся для этой цели питательные среды. Проконтролированная на бактериальную чистоту и специфичность (реакция агглютинации) нативная эмульсия разливается градуированной пипеткой в 1-2 слг е оттянутым концом в ампулы нейтрального стекла. Ампулы изготовляются из стекла «Пирекс или дрота марки N° 23 и имеют в середине перетяжку. Открытый конец ампулы закрывается ватной пробкой. Градуированные пинетки меняются по мере их использования. Набирать одной пипеткой нативную эмульсию не рекомендуется во избежание бактериального загрязнения нативной эмульсин. При наличии большого количества нативной эмульсии разливка по ампулам производится прибором (сифопо.м) с «колокольчико.м и приспособлением для отмеривания определенного количества эмульсии.

Практически нативная эмульеия разливается в ампулы is количестве 1,0-2,0 слг. После разливки в ампулы нативная эмульсия поступает для высуилнвания в вакуум-аппарат типа флосдорфа. Высушивание эму. производится с замораживанием или без него. Ампулы с нативной эмульсией погружаются в мелкораздробленный лед, перемешанный с поваренной солью, и выдерживаются в нем 20-30 мин., то сеть пока содержимое амнул не замерзнет. После этого включается масляный насос и, как только вакуум в аппарте достигнет не ниже р 0,098, лед убирается. Вакуум быстро иодннмается, через 40-50 мин достигает / 0,035-0,032 и сохраняется на этом уровие на протяжении всего периода работы аппарата. Высушивание пативпой эмульсин продолжается 18- 24 час, после чего производится запайка ампул. Если процесс сутки идет без замораживания, то отпадает процесс погружения ампул с наттиюй эмульсией в лед, и они сразу нодвергаются Aciiствию высокого вакуума ,035-0,032 в течение 18- -24 час. После этого амнулы идут на запайку. В обеих случаях выеун ивания -как с замораживанием, так и без него-запайка ампул происходит в условиях высокого вакуума. Ампулы с сухой нативной эмульсией контролируются тщательным осмотром на герметичность.

Контроль ПЭМ на растворимость. Ампула с высущенной нативной эмульсией вскрывается с соблюдением нравил асептики. Содержимое эмульгируется в физиологическом растворе и осторожно отсасывается в пробирку, в которую добавляется физиологический раствор в количестве, пеобходимом для получения стандарта 100 млн. микробных тел в 1 см Пробирка должна быть чистая, прозрачная и не должна содержать посторонних примесей. После растворения сухой бактериальной массы должна получаться однородная, гомогенная вакцинальная эмульсия без хлопьев и прочих включений. Нормально сухая нативпая эмульсия растворяетея в течение 3-4 мин.

Микроскопия. Капля эмульгированной в физиологическом растворе нативной эмульсии из амнулы распределяется тонким слоем на пред