Способ изготовления вакцины против трихофитии крупного рогатого скота Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 A61K35/70 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к способу изготовления вакцины против трихофитии крупного рогатого скота. В настоящее время известен способ изготовления препарата ТФ-130 против трихофитии крупного рогатого скота включающий приготовление питательной среды для выращивания культуры Trichophyton fariforme штамм 13р, засева, выращивания культуры, съема, гомогенизации культуры и разбавления ее физиологическим раствором PJ Недостатком данного способа являе ся то, что полученный препарат имеет короткий срок годности и требует жес кий температурный режим хранения. Известен также способ изготовлени .вакцины ЛТФ-130 против трихофитии крупного рогатого скота, состоящий из приготовления питательной среды на основе сусло-агара для выращивания культуры Trichophyton fariforme штамм 130, засева, выращивания, съема кипения, гомогенизации культуры, приготовления защитной среды и ее дробной трехдневной стерилизации при too С, смешения гомогената с защитной средой в соотношении 1:1, расфасовки, заморозки и сублимационной сушки в аппаратах КС-30 и ТТ-50 2 . Недостатком данного способа является низкое спороношение культуры Tryhophytoti fariforme штамм 130 и низкий выход вакцины, а также то, что для вьфащивания культуры брали сусло без учета его кислотности. Размол-культуры и гомогенизатора не всегда обеспечивал выход мелкодисперсной массы, что неблагоприятно отражалось на качестве вакцины и ее выходе. Сублимационную сушку вакцины проводили в аппаратах КС-30 и ТГ-50 однако не регулировали автоматически температуру полок. Это неблагоприят но сказывалось на качестве вакцины. Цель изобретения - повьш1ение иммуногенности вакцины и сокращение технологического щкла. Для достижения указанной цели в способе, включающем приготовление питательной среды, состоящей из сус ла и агара, выращивание на ней куль туры гриба, съем, гомогенизацию, до бавление антибиотиков, приготовлени защитной среды, содержащей сахарозу и желатин, стерилизацию защитной среды,смешивание гомогената с защитной средой, расфасовку,замораживание и сушку, в качестве культуры гриба используют диюую культуру ТФ-130 Л, выращивание ее проводят до концентраций 250-650 млн. жизнеспособных микроконидий на 1 МП питательной средал на сусло-агаре с кислотностью 1,8-2,4, причем стерилизацию защитной среды проводят паром в течение трех дней по 30 мин, а сушку проводят при температуре 20-40 С в течение 26-60 ч,П р и м е р. Приготовление питательной среды. Питательной средой для выращивания культуры Trichophytort fariforrae 130 Л пои изготовлении вакцины ТФ-130(К) служит суслоагар, Для приготовления сусло-агара используют пивное неохмеленное сусло с кислотностью . Сусло подвергают дробной стерилизации текучим паром в течение 3 дней по 30 мин ежедневно. Простерилизирозанное сусло может храниться 30 дней при температуре не вьш1е . Пивное сусло разводят водопроводной водой (ГОСТ-284-73) или дистиллированной водой (ГОСТ-609-72) до содержания углеводов по Баллингу 7-8%, запивают в варочный котел и устанавливают рН до стерилизации 7,0-7,4, а затем добавляют 2,5-3,0% агарагара (микробисатогический ГОСТ-1720671), кипятят до растворения агара, фильтруют .через ватно-марлевый фильтр, разливают в стерильную посуду матрицы по 300 мл и в пробирки по 7 мл. Стерилизуют 40 мин при . 0,5-0,7 атм. После стерилизации сусло агара рН должна быть в пределах 6,3-б, 8, Матрацы с суслом агара после стерилизации дпя контроля на отсутствие микрофлоры вьщержиьают 2-3 суток в термостате при 26 и . Затем их тщательно просматривают на,чистоту. Приготовление защитной среды. В качестве защитной среды (среды высушиваиия) используют стерильный водный раствор, содержащий 20% сахароэы (ГОСТ-5833-54) и 4% желатина (пищевой ГОСТ-11293-65), Для приготовления среды в горячую дист шшированную воду добавляют желатин из расчета 4% и после растворения сахарозу из расчета 20% (по весу на взятый объем воды, фильтруют и устанавливают рН 7,0-7,4. Стерилизую текучим паром 3 дня подряд по 30 мин После стерилизации рН должен быть в пределах 6,2-6,8. Хранят в холодил нике при 2-8 С не более 15 дней. Защитную среду проверяют на стерильность. Для этого берут пробу сре ды, из которой делают высевы (по 1-2 капли) по две пробирки на МПА., ШБ, Китт-Тароцци, сусло агар и агар Чапе ка (помещают в термостат при 26°С) по две пробирки с МПА, МПБ и Киттт Тароцци помещают в термостат на 10 дней при температуре 37 С. После термостатирования посевов в течение 5 суток при 37 С их просматривают и с МПБ и Китт-Тароцци пересевают на те же питательные среды и выдержи вают еще.в течение 5 суток при указанной температуре. Посевы должны быть чисть1ми и не давать роста микро флоре. Посев и вырапшвания культуры T.fariforme 130 Д. При посеве культуры из диофильно высушенного состояния для полного восстановления ее энергии роста требуется три пассажа. Ампулу вскрывают над пламенем горелки, пастеровс кой пипеткой вносят в нее физиологический раствор до полного растворени культуры. Полученную взвесь перенося во флакон, содержащий 25 мл стерильного физиологического раствора с рН 6,4-7,0. Грибковую суспензию выде живают после растворения в течение t ч при комнатной температуре, з-атем высевают по 5 мл на 4-5 матрацев и ставят для выращивания в термостат при 26 С на 12-14 дней. Периодически культуру просматривают макроскопически (визуально) на наличие постороннего загрязнения. Рассев культуры для получения второй генерации делаю через 12-14 дней после макроскопичес кого и микроскопического исследования культуры, затем еще через 1015 дней делают рассев для получения третьей генера1щи. Третью генерацию культуры берут как производственную для последующих расплодок, предварительно проверив на чистоту, концентрацию и жизнеспособность микроконидий. Для получения посевного материала 10-15-дневную культуру Т. far if urine .130 Л, выращенную на сусло агаре в матрацах, смывают 150-200 мп стерильного физиологического раствора. Полученную взве.сь- набирают пипеткой Мора или вставляют сифон в матрац и засевают новые матрацы с суслоагаром (из расчета 5-7 мл грибной взвеси на один матрац). На каждом матраце отмечают номер штамма и дату засе- . ва. Количество засеваемых матрацев определяется объемом выпуска вакцины. Засеенные матрацы ставят в термо-. стат в полунаклонном положении и выдерживают при температуре 26-28 С. Выращивание культуры производят в течение 12-15 дней. Заметный рост на сусло агаре появляется на 3-5-й день. Культура должна покрывать всю поверхность сусло агара, В процессе вьфапщвания матрицы с культурой T.fariforme визуально просматривают, .начиная со второго дня, через каждые двое суток на наличие постороннего загрязнения. При бактериальном или грибковом загрязнении матрацы выбраковывают и немедленно отправляют в убивку (автоклавирование в течение 1 ч при 2.атм). Культура T.fariforme 130 .Л в матрацах для производственных целей может храниться в холодильнике при температуре в течение 10 дней. Съем и гомогенизация.грибковой массы. Матрацы с культурой T.fariforme 130 Л предварительно протирают спиртом, затем открывают пройки под горящими спиртовками или газовыми горелками. Специальными скребками снимают грибную массу с поверхности сусло агара и с соблюдением стерильности помещают ее в стерильные банки с крышками или чашки Петри для последующего стерильного измельчения в гомогенизаторе, миксере или коллоидной мельнице. Съем грибной массы следует вести, не захватывая питательную среду. Для размола грибной массы исполь- уют гомогенизаторы (миксеры) азличных марок или коллоидные мельицы (1У-8, 1У-10). В течение всего ремени загрузки, измельчения и ыгрузки биомассы температура в рабоих камерах (емкостях, где измельается и циркулирует биомасса) гомо-. енизаторов и коллоидных мельниц е должна быть вьш1е 30 С.

Режим работы ксхплоидной мельницы. Для измельчения грибной массы, снятой с сусло-агара, могут быть использованы коллоидные мельницы с внесенными дополнениями в их . конструкцию. Основным дополнением является съемная доводка (закрытый бункер), изготовленная из нержавеющей стали. В верхней крышке бункеров имеется герметически закрывающийся загрузочный люк диаметром 100 мм и два штуцера по 22 мм, один из которых используется для подачи стерильного воздуха в бункер, а второй посредством вакуумной трубки и тройника соединяется с выходным патрубком коллоидной мельницы (для обеспечения циркуляции грибной массы во время размола).

Перед началом работы съемный бункер присоединяют к коллоидной мельнице. Один из штуцеров бункера посредством вакуумной трубки через тройник соединяют с выходным патрубком мельницы и бутылью (через короткий сифон) а другой - с системой сжатого воздуха.

В целях исключения поступлений воздуха в бункер и попадания в него посторонней микрофлоры включают систему подачи стерильного воздуха, что позволяет в момент загрузки массы поддерживать избыточное давление.

Через люк загружают в бункер грибную массу, антибиотики пенициллин и стрептомицин (из расчета, по 100 ед на 1 мл) и заливают стерильный физиологический раствор. В бункер емкостью 40 л загружают культуру гриба, снятую приблизительно с 65 матрадев. На это количество грибной .массы в бункер заливают 10-13 л физиологического раствора.

Загрузочный лкж бункера герметически закрывают, прекращают подачу стерильного воздзоса, регулирунлцим устройством устанавливают.ножи на нулевую отметку, затем включают коллоидную мельницу, которая производит размол грибной массы в течение 57 мин. В этот период суспензия (концентрат) грибной массы циркулирует по закрытой системе (из бункера в коллоидную мельницу и через вакуумную трубку вновь в бункер и т.д.).

Для исключения попадания суспензии в баллон вакуумная трубка, соединяющая тройник с бутьшью, зажимается зажимом.

По истечении указанного срока времени работы коллоидной мельницы вакуумную трубку, соединяющуюбункер с выходным патрубком мельниць, пережимают зажимом, а зажим со сливной трубы снимают. Перекачка грибной массы в бутьть проводится при включенно мельнице с одновременной подачей стерильного воздуха в бункер. Измельченная грибная масса поступает в бутыль, которая имеет два сифона (длинный и короткий), вмонтированные в пробку. Короткий сифон служит для приема грибной массы в бутьть из мельницы, а также для создания избыточного давления в момент слива содержимого в реактор при составлении серии вакцины. К наружному концу длинного сифона присоединяют 1,52,0-метровую резиновую трубку, через которую берется проба для проверки стерильности.

. Цеховой контроль грибной суспензи Из полученной после развода концентрированной грибной массы с соблюдением стерильности берут пробу для проведения цехового контроля, определяют концентрацию грибной массы, количество микроконидий, проверку на отсутствие посторонней микрофлоры путем высевов по две пробирки на МПА, МПБ, Китт-Тароцци, а для выявления плесневых грибов на пробирки с агаром Чапека и сусло агаром. UQсевы вьадерживают в термостате при 37 и в течение 5-7 суток- По истечении указа нного срока пробирки визуально просматривают.

Из пробирок с культурами на указанных средах делают мазки и просматривак т их в иммерсионной системе.

При наличии посторонней микрофлоры суспензию уничтожают: путем автоклавирований при 2 атм в течение 1 ч.

Бутыли с концентрированной грибной массой можнЬ хранить в течение 5-7 суток в холодильнике при температуре .

Соединение гомогената с защитной Средой. При получении положительных результатов цехового контроля приступают к смешиванию гомогената с защитной средой. Бутыпь с гомогенатом при помощи стерильного шланга присоединяют к другой стерильной бутыли или ферментеру, снабженному мешалко куда перекачивают защитную среду высушивания и гомогенат в соотношении 1:1. Предварительно определяют кочцен рации гомогената по БОСМ №10, исход из того, что 1 млрд. по БОСМ прибли зительно соответствует 6-10 млн. микроконидий в 1 мл. Используют гом генат, содержащий 360-600. млн/м.п микроконидйй, что соответствует приблизительно 40-60 млрд. по БОСМ. Всю работу проводят в стерильном выше 25 С. боксе при температуре не Бутьть с гомогенатом устанавлива в шуттель-аппарат и тщательно перем шивают содержимое или используют ферментер с мешалкой, затем при периодическом перемешивании проводя розлив вакцины. Розлив по флаконы. Вакцину расфа совывают по 2,5 или 5-мл в стерильные пенициллиновые флаконы (МРТУ 64-2-15-15-69) емкостью 10 мл и п 10 мл в пенициллиновые флаконы емкостью 20 мл, что соответствует 10,20 и 40 дозам вакцины. Сублимационная сушка вакцины ТФ-130 К. Сушка вакцины состоит из двух процессов: замораживания проду та в низкотемпературном холодильнике и последующей сублимации (лиофил зации) в сублимационном аппарате. Кассеты с материалом сразу после розлива помещают в охлажденную от -40 до -50 С камеру холодильника типа КС-70/250 или другого типа, обеспечивающую указанную температзф В 2-3 флаконах с вакциной в разн кассетах устанавливают датчики для снятия показаний температуры продук та в процессе сублимации. Материал промораживают при данной температур в течение 6-20 ч. Кассеты с замороженной вакциной в течение 2-3 мин, не допуская оттаивания продукта,, перегружают в подготовленную и охлажденную камеру (в аппарате КС-30 охлаждают камеру от -40 до -50 С, в аппаратах ТГ - от -30 до -50 С, подключают датчики, закрывают (дверцу) камеры и включают вакуумные насосы. Спустя 1-3 ч при достижении показателей вакуума 9-10 (аппарат КС-30) включают нагрев полок до температуры 35-40 С. Нагрев поддерживают при данной температуре до достижения температуры продукта от -8 до -10 С а затем повышают нагрев полок до 25 С и вьздерживают его до окончания сушки. В течение всей сушки нагрев полок пЪддерживают таким образом, чтобы температура продукта повьш алась в 1 ч на . Продолжительность сушки составляет 38-96 ч. В аппарате ТГ-50 продолжительность сушки составляет 18-96 ч. После завершения сушки камеру через специальный фильтр заполняют сухим стерильным воздухом или нейтральным газом. Кассеты, закрытые марлевыми салфетками, переносят в бокс, флаконы над спиртовкам закрывают стерильньг ш резиновыми пробками, закатывают, мeтaлличecки & колпачками н зтикируют. Хранят вакцину при тe u epaтvpe 2-10с. Контроль вакцины ТФ-130(К)о Вакцину подвергают контролю на. растворимость j наличие механическггх примесей и других посторонних включений, остаточную влажность, отсутствие контa fинaцIIи посторонней мтткрофлорой, количеств.о мтгкроконидий, типичность роста и морфолопгческие признаки культуры, использованной для ее приготовления, жизнеспособность микро- конидий, безвредность, ,HDгeннyю активность. Растворимость, Д.гтя определения растворимости во флаконы с вакциной вносят 10 мл растворителя (рН 6,27,0). Содержимое флакона при встряхивании должно, растворяться в тече- . ние не более 2-3 ьт и пмоть вид гомогенной взвеси. Механические примеси. Для вьювления механическ1.гх примесей и.других посторонних включений флаконы с растворенной вакциной прос атривают в проходящем свете. Флаконы, включаюпще механические примеси и другие посторонние включения, бракуют. Для определения внешнего вида, наличия механических примесей и друГР1Х посторонних включ.еняй флаконы с сухой вакциной просматривают при встряхивании на свету, после чего проверяют их на плотность укупорки. Для определения остаточной влажности берут 3 навески из отдельного флакона каж,цую и высушивают при температуре 100-105 С в течение 1 ч. Содержание влаги (А) в процентах определяют по формуле . .(ВгО- 100 f где С - вес навески после высушивания , г; В - первоначальный вес навески (вес вакцины), г. За окончательный результат принимаю среднее арифметическое результатов всех проб. Остаточная влажность каж дого флакона из проверяем 1х флаконо с вакциной должна быть в пределах 1,0-3,5%. Для проверки отсутствия контамин ции посторонней микрофлорой берут 5 флаконов с вакциной, разводят .из расчета 1 доза в 5 мл растворите ля и высевалот на питательные среды Из каждого флакона по 1-2 капли высевают на питательные среды в про бирки: сусло-агар, агар Чапека, МПА,.М11Б и Китт-Тароцци. Посевы на сусло-агаре и агаре Чапека, а та же и.по две пробирки на МПА, МПБ и Китт-Тароцци вьщерживают в термо стате при 26°С в течение 10 дней. П две пробирки высевов на средах МПА МПБ и Китт-Тароцци вьщерживают з термостате при 37°С в течение 10 д После термостатирования. посевов в течение 5 суток при 37 С их просма ривают с МПБ и Китт-Тароцци пересе вают на те же питательные среды и держивают еще 5 суток при указанно температуре. Посевы должны быть чистыми и не давать роста посторонней готкро- флоры. Пробирки со средой Китт-Тароцци предварительно прогревают в водяной бане при 30°С в течение 30 мин и затем охлаждают до 18-20 С. Типичность роста. Посев на сусл агар должен давать характерный рос T.fariforme культуры 130 Л ( при засеве суспензией) в виде ровной, порошистой, зернистой, стелющейся беловатой грибницы. При микроскопии морфологические элементы представлены бесцветным, септированным, ровным мицелием, в диаметре 2-5 мкм. Микроконидии, овальной, округлой, грушевидной или палочковидной формы в диаметре 1-2 мк. Проверку количества микроконидий, жизнеспособности микроконидий и контаминации проводят из одних и тех же флаконов спустя 2 ч после ресуспензироваийя вакцины. Количество микроконидий определяют путем подсчета их в счетной камере Горяева. 1 мл вакцины должен содержать не менее 6 и не более 12 мпн. микроконидий. Жизнеспособность микроконидий определяют в каждом из 5 флаконов контролируемой серии. Проверку вакцины на жизнеспособность микроконидий проводят проводят спустя 2 ч после ресуспендирования вакцины. На каждый флакон берут 5 пробирок и в каждую пробирку пипеткой или бюреткой наливают по 4,5 мл растворителя (рН 6,2-7,0). Флакон с вакциной встряхиваютJ берут из него 0,5 мп суспензии и вносят в первую пробирку, перемешивают содержимое легким встряхиванием пробирки и новой пипеткой берут 0,5 мл и переносят во вторую пробирку и т.д., т.е. приготавливают разведения от 10 до 10. Запрещается перемешивание пробирок пипеткой во избежание оседания на стенках пипетки микроконидий. Из пятой пробирки каждого флакона пипеткой засевают по 0,5 мп в. каждую из двух чашек Петри. Всего 10 чашек на серию. Легким покачиванием чашек распределяют суспензию по поверхности питательной среды. Засеянные чашки Петри помещают в термостат при 26 С. Количество вьфосших колоний подсчитывают на 7-9-й день, используя счетчик для подсчета колоний. Суммируют количество выросших колоний в 10 чашках Петри, полученный результат делят на 5 и умножают на 10 (степень разведения). КонечнЬй результат соответствует количеству жизнеспособных микроконидий в 1 МП вакцины. Количество жизнеспособных микроконидий в каждом флаконе должно быть не менее 4 млн. и не более 12 млн. в 1 мл. Безвредность вакцины проверяют на McjpcKHx свинках или белых мьппах по трем флаконам. На 1 серию берут 6 морских свинок массой 300-350 г или 6 белых мышей массой 15-20 г. ПЬдкожно в область спины вводят морским свинкам по 0,2 мл, белым мышам по: 0,1 мл вакцины, ресуспензированной из расчета 1 доза в 1 мл растворителя. Наблюдение за животными ведут в течение 10 дней. Животные за время наблюдения должны оставаться живьми при удовлетворительном общем состоянии . Каждая десятая серия проверяется на иммуногенную активность на 6 телятах 1-4-месячного возраста, ранее не иммунизироваиньк вакциной ТФ-130 (к) и не болевших трихоЛитией Для этого используют 3 флакона, вакцины. Иммунизацию проводят соглас но наставлению по применению вакцины ТФ-130 К. Критерием оценки активности служит образование у животных спустя 10-14 дней после второй иммунизации на месте введения вакцины на поверх ности кожи специфической локализован ной корочки. Один раз в шесть месяцев одна серия вакцины проверяется путем иммуни зации и последующего зкспериментального заражения. Спустя месяц после второй иммунизации 6 опытных и 3 кон рольных (не иммунизированных) телят заражают Месячной вирулентной культу рой T.fariforme путем втирания гомогената в предварительно выстриженный и скарифицированный участок кожи в средней трети шеи. Учет результато проводят спустя 40 дней после заражения. Из 6 иммунизированных телят 5 не должны иметь клинических призна ков трихофитии. Все контрольные телята должны проявить клиническую картину заболевания, которую подтвер ждают микроскопическими исследования ми. Вакцина ТФ-130 (К) против трр1хофитии крупного рогатого скота представ ляет собой однородную, аморфную, пористую, иногда кристаллическую сухую массу в виде тюбика без посторонних примесей серого цвета. Срок годности,вакцины ТФ-130 (К) 18 месяцев со дня изготовления и хра нения ее при температуре и соблюдения правил транспортировки, хранения и применения. Для производства одной серии вакцины ТФ-130 (к) объемом 170тыс. доз необходимо расфасовать вакцину во флаконы по 10 мл в количестве 4680 штук, из которых 430 штук могут быть выбракованы по различнымпричинам (бой во время заморозки, бой во время обкатки, этикировки и т.д.) а деловых флаконов останется 4250 штук, Сь.1рья требуется для заполнения этих флаконов 4680x10 ,8 л. Потери при розливе вакцины составляют 2,5%, следовательно, сырья требуется 48,0 л. Для приготовления 48,0 л сырья необходимо иметь 24,0 л гомогената с концентрацией микроко- . нидий 320 млн/мл и 24,0.л защитной среды. При съеме грибной массы и ее перемоле с одного матраца получается 100 мл гомогената. Вакцину против трихофитии крупного рогатого скота применяют с профилактической -И лечебной целью. С профилактической целью ее вводят двукратно внутримышечно в область бедра в дозе 1-2 мл, а с лечебной целью 2-4 мл, в обоих случаях с интервалом 10-14 дней, Вакцина ТФ-130(К) по сравнению с вакциной ЛТФ-130 обладает более высокой иммуногенностью, повышенной концентрацией и жизнеспособностью микроконидий. Выход вакцины с одного матраца увеличивается в 3-4 раза за счет повьшзения спорообразовакня культуры ТФ-130 Л и уменьшения вводимого объема растворителя, Вводимая доза вакщшы в 5 раз меньше по сравнению с вакциной ЛТФ-130, Технико-экЬно№-1ческий эффект, Ранее одна доза сухой вакцины ЛТФ-130 растворялась в 5 мл специального растворителя, для чего промьшшенностью ежегодно выпускалось 800 тыс,л растворителя по цене 1,56 руб, за 1 л на cyMMj 1248 тыс, руб. При новом режиме одна доза сухой вакцины Ф-130 (к) растворяется в 1. мл специального растворителя, что позволит сократить его промышленный вьшуск о 160 тыс.л, (800:5 160) и снизить затрата на изготовление до 249,6 тыс,руб (160x1,,6), Экономический эффект составляет (1248-249;,.6)998,4 тыс,руб. Экономическая эффективность внедреия культуры ТФ-130 Л на Ставропольсой биофабрике. Всего за 1975-78 г. из культуры Ф-130 Л изготовлено 92 146 000 доз. кономия, руб: По питательной среде 2285 Матрацев43240

3955570.14

Себестоимости652,764 руб. За 4 года в среднем

вакцины607242. экономичёс1(ий эффект от внедрения

В 1977 г, на четырех биофабриках культуры ТФ-130 Л ВГНКИ составил (Ставропольской, Приволжской, Гали- -2 млн.руб. шинской. Омской), произведено вакцины 5 Годовой эффект от внедрения ЛТФ-130 t35, 231 тыс.доз. Годовой концентрированной вакцины ТФ-130 (К) экономический эффект составил (998 4+652,7) 1 .650 тью.руб.

Способ изготовления вакцины против трихофитии крупного рогатого скота, включающий приготовление «питательной среды, состоящей из cyc,iia и агара, выращивание на ней культуры гриба, съем, гомогенизацию, добавление антибиотиков, приготовление защитной среды, содержащей сахарозу и желатин, стерилизацию защитной среды, смешивание гомогената с защитной средой, расфасовку, замораживание и сушку, отличающийся тем, что, с целью повышения иммуногенности вак1щны, в качестве культуры . гриба используют живую культуру- J ТФ-130 Л, вырапщвание ее проводят до концентрации 250-650,млн. .жизне(Л способных микроконидий на 1 мл пита тельной среды на сусло-агаре с кислотностью 1,6-2,4, причем стерилизацию защитной среды проводят паром в течение трех дней по 30 мин, а сушку проводят при температуре 20-40 С в течение 26-60 ч.