Способ получения иммобилизованных биокатализаторов Советский патент 1979 года по МПК C12N11/08 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ .

Изобретение относится к технологическим процессам биохимического превращения органических веществ и может найти применение в микробиологической, химической и медицинской промышленности.

Известно применение биоорганических катализаторов, в частности иммобилизованных ферментов или ферментных систем, для превращения органических веществ, необходимых для медицинской, химической и пищевой отраслей промышленности.В этих целях нере ко используется иммобилизация не тол ко отдельных ферментов,а также целых интактных клеток микроорганизмов Иммобилизация клеток микроорганизмов дает возможность устранить сложные дорогостоящие процессы выделения и очистки исходных ферментов, и проводить сложные ферментативные реакции одностадийным процессом.

Чаще всего иммобилизацию клеток осуществляют включением активной клеточной культуры в полиакриламидный гель путем совместной полимеризации акрильных мономеров с клетками микрЪорганизг ов. Данньй метод широко приме но для иммобилизации клеток

микроорганизмов с различной ферментативной активностью. Например, таким способом получены иммобилизированные клетки, обладающие глюкозооксидазной 1 или аспартазной активностью 2 .

однако применение биокатализаторов такого типа в технологических :установках в непрерывных процессах

0 часто затруднено из-за недостаточных гидродинамических показателей биокатализаторов, полученных путем включения клеток микроорганизмов в мягкие гидрогели, в частности полиакриламид5ные. Применяемыегели, например полиакриламидный, во время длительной эксплуатации набухают, а под действием гидростатическогЬ давления слой катализатора уплотняется. Эти явле0ния приводят к резкому увеличению гидравлического сопротивления массы катализатора в установке закупорки систем, что затрудняет поддержание требуемого режима в установке.

5

Известен способ получения иммобилизованных биокатализатороЕ путем включения биокатализатора в армированный неорганическим скелетом гидрогель. Исходными компонентами реак0ционной смеси являются ферментный белок, 7-.2%-ньг1 полиакриламидный . гель с COOTношением акриламида к метиленбнсЕлКриламиду 19:1 до 18:2 и инициаторы, например тетраметилэтилендиамин, коториди пропитывают пористый неорганический материал типа силохрома 3. После осуществления полимеризационного процесса частицы с ферментативной активностью находят применение в технологических процессах в колонках различного типа. При этом неорганический скелет катализатора обеспечивает необходимую механическую прочность материала и тем самым долговечность применения. Недостатком данного способа явля ется чрезвычайно низкая эффективност процесса иммобилизации ферментативн актирных клеток микроорганизмов или их фрагментов. Обычные пористые носи тели, применяемые для иммобилизации ферментов и могущие быть неорганической основой для получения армированных катализаторов, обладают мелкими порами, и впитывание микро-организмов в эти поры невозможно, а увеличение размеров пор приводит к снижению прочности материалов и не позволяет получить армированные катализаторы с необходимыми эксплуата ционными свойствами с помощью орган ческих материалов. Целью изобретения является упрощение процесса и улучшение эксплуатационных свойств получаемого биока тализатора. Поставленная цель достигается применением такого носителя, в котором крупные поры сочетаются с достаточной механической прочностью и устойчивостью в водной среде. При этом иммобилизованные биокатализаторы получают путем включения клеток E.coli в-качестве биокатализатора в армированный неор ганическим скелетом, в качестве кот рого применяют измельченный силикал цит с диаметром частиц 0,1-1,2 мм, обработанный раствором однозамещенного фосфата натрия с последующей термической обработкой при 110-15iO в течение 1-15 час, 7-12%-ный полиакриламидный гель с cooTHODjeHHeM акриламида к метиленбисакриламиду 19:1 до 18:2. Силикальцит, применяемый в качес ве строительньтх материалов, содержит .довольно много свободной извест которая в водной среде сдвигает рН среды в щелочную сторону и вы мывание которой уменьшает прочность мат риала. При обработке ячеистого сили кальцита и подобных материалов , растворами фосфорнокислых солей при в течение 1-15 час на внутренней поверхности материала об разуется слой фосфорнокислого кальция. Это снижает вымываемость своодной извести без уменьшения разме ра пор, но закрепляет структуру исходного материала. Обработанный таким образом силикальцит может долгое время храниться перед применением его для получения биокатализаторов из ферментативно активных клеток, мономеров и инициаторов полимеризационного процесса. Сравнение работы полученных армированных биокатализаторов с работой колонок с клетками, иммобилизированньн ш в неармированном прлиакриламидном геле, показывает, что армированные гели обладают более .высокой аспартазной активностью чем свободные клетки. Кроме того, колонка, заполненная биокатализатором, полученным на основе армированного силикальцитом полиакриламидного геля, работает непрерывно в течение двух недель без изменения гидродинамических свойств и скорости протекания субстрата, а также без снижения производите льнрсти. Получение- препаратов с иммобили-. зованными микробными клетками, обладающих аспартазной активностью, а также применение полученныхпрепаратов для превращения фумарата аммония в аспаргиновую кислоту поясняется следующими примерами. Пример 1, В качестве ферментативно активного материала используют суспензию клеток E.coli с аспартазной активностью. Клетки E.coli выделяют из культурной среды и промывают водой с последующим центрит фугированием в течение 10 мин при 9000 д. Суспензия клеток микроорганизма содержит 14,9 мг белка в 1 мл, имеет удельную аспартазную активность 211 ед, на 1 мг белка за 1 час. В качестве носителя используют пеносиликальцит с объемным весом 0,9 т/м, удельной поверхностью .140 тл /г, удельным объемом пор до 0,27 и размером частиц 0,1-1,2 мм. Исходный материал обрабатывают 20%-ным водным раствором , в течение 3 час, соблюдая соотношение 2 мл/г, операцию обработки проводят еще 2 раза. Образуемый осадок фосфатов кальция отделяют декантированием, а обработанный носитель промывают дистиллированной водой в соотношении 10:1 (носитель-вода) и высушивают при 110°С в течение 12 час, а затем прогревают при в течение 2 час. Реакционную смесь для иммобилизации клеток микроорганизма готовят из 3,6 мл описанной суспензии клеток E.coli, 1,0 мл 50%-ного раствора мономеров (соотношение акриламида к метиленбисакриламиду 19:1), 0,1 мм 20%-ного раствора надсернокислого аМЛония, 0,1 мл 50%-ного раствора тетраметилэтилендиамина и 300 мг кристаллической калиевой соли аспар гиноВой кислоты. При помощи получен ной реакционной смеси пропитывают 5,5 г гранул обработанного сухого силикальцита. Пропитку проводят при . После выдерживания в течение 10-15 мин для завершения полимеризационного процесса полученный блок с гранулами силикальцита фрагментируют и промывают 100 мл дистил лированной воды. Готовый сырой ката лизатор (10 г) в виде армированного полиакриламидного геля с включенным клетками микроорганизма обладает удельной аспартазной активностью 289 ед. на 1 мг белка за 1 час, а общей - 4400 ед., что составляет 53 от исходной общей активности, внесенных при иммобилизации свободных клеток E.coli. Пример 2. Используют суспе зию клеток и носитель, описанные в примере 1. Для иммобилизации клеток микроорганизма применяют следующий порядок операций:60 г силикальцита пропитывают 25 мл суспензии клеток добавкой 3,0 г кристаллической кали вой соли аспаргивной кислоты.Пропитанные суспензией клеток гранулы си ликальцита охлаждают до и до бавляют 22 мл полимеризационной сме полученной смешиванием 10 мл 50%-но раствора мономеров, содержащего акриламид и метиленбисакриламид в соотношении 19:1 соответственно, 9,0 и 0,1 М фосфатного буфера (рН 8,0) и 3,0 мл 10%-ного тетраметилэтилендиамина. Последний компонент в качестве инициатора полимеризации (надсернокислый аммоний -3,0 мл 10%) добавля ют непосредственно перед пропиткой силикальцита указанной смесью. Пропитанный раствором носитель обрабатывают, как описано в примере 1. Получают 113,8 г катализатора, общая аспартазная активность которого 59.255 ед., что составляет 89% от исходной общей аспартазной активности внесенных свободных клеток. Удель ная аепартазная активность иммобили зованных 3 армированный силикальцитом полиакриламидный гель на 69% выше, чем исходных свободных клеток Пример 3. Биокатализатор, полученный по примеру 2 и имеющий удельную аспартазную активность 55 ед. на 1 мг белка за 1 час сразу после получения, высушивают при до воздушно-сухого состояния. Из 40 г влажного катализатора получают 27,6 г сухого материала, его хранят в сухом виде в закрытых склян ках в холодильнике при б°С в течение 60 дней. После выдерживания к 6,9 г материала добавляют 0,1 М фосфатный буфер до общего объема 15 мл и после набухания гранул носителя в течение 20 мин определяют -аспартазную активность. Удельная аспартазная актив /ость препарата 54 ед/мг белка, что составляет 98% от активности перед высушиванием. Пример 4. 70 г катализатора, полученного по примеру 2, помещают в стеклянную колонку размерами 3x10,5 см, снабженную водяной , рубашкой. Колонку термостатируют при 37С и пропускают через нее 1М раствор фумарата аммония (рН 8,5) со скоростью 30 мл/час. Элюат, вытекающий из колонки, по данным анализа содерокит 90 мг/мл аспаргивной кислоты и 7,4 мг/мл фумаровой кислоты, что соответствует степени конверсии 82%. К 1 л элюата добавляют 140 мл концентрированной серной кислоты. Выделяющиеся кристаллы аспаргивной кислоты отделяют фильтрованием, промывают холодной дистиллированной водой и этиловым спиртом, а затем высушивают на воздухе. Получают 85 г аспаргивной кислоты, которая по полярографическому анализу имеет + 21,4, что соответствует 87% содержанию аспаргивной кислоты в -форме. т.пл. 270°С и элементарный состав,%: С 36,41, Н 5,28 и N 9,43, что близко к теоретическим значениям. Колонку с гранулами биокатализатора используют для непрерывного протока 1 М фумарата аммония в течение 15 суток. При этом скорость протекания реакционной смеси через колонку уменьшается лишь на 10%, а работоспособность колонки, определяемая по синтезу целевого продукта оС-аспаргиновой кислоты, не меняется. Данный способ позволяет получить биокатализаторы более эффективным методом для осуществления процессов превращения химических веществ непрерывными методами. Включение клеток микроорганизмов при полимеризации акриламидного геля в порах макропористого неорганического носителя позволяет получать дешевый и технологически удобный биокатализатор. Армированные неорганическими носителями гидрогели с иммобилизованными клетка и микроорганизмов могут быть длительно использованы без ухудшения гидродинамических показателей в непрерывных процессах получения различных природных соединений. Кроме того, полученный катализатор можно высушить и хранить в сухом- виде длительное время, он обладает высокой гидродинамической и энзиматической стойкостью. Формула изобретения Способ получения иммобилизованных биокатализаторов путем включения

оиокаталиэатора в армированный неоргаирг еским скелетом 7-12%-ный полиакриламидный гель с соотношением акриламида к метиленбисакриламиду 19:1 до 18:2, отличающийс я тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения эксплуатационны свойств целевого продукта, в качестве биокаталиэатора используют клетки E.coli, а в качестве неорганического скелета - измельченный сили,кальцит с диаметром частиц 0,1-Г,3-мм, обработанный раствором однезамещенного фосфата натрия с последующей термической обработкой ripH 110-150°С в течение 1-15 час.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

кл. С 07 С 101/22, опублик. 1972.

3.Авторское свидетельство СССР 530885, кл. С 07 G 7/02, 1974 прототип).