Способ получения -аспарагиновой кислоты Советский патент 1979 года по МПК C12D13/06 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L -АСПАРАГННОВОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к технике получения L -аспарагиновой кисло и может быть использовано в микробиологии, медицине и пищевой промышленности. Известен способ получения U -ас рагиновой кислоты путем смещения с пензии клеток микроорганизмов,например Реей domona 6 Eit ultaciens , с 1 М (11,6%) водньлм раствором фумар та аммония- и толуолом с последующей инкубацией в течение 48 ч при Э7°С, Недостатком известного, способа является его длительность, загрязнение целевого продукта примесями и периодичность. Известен также способ получения Ь -аспарагиновой кислоты путем куль тивирования микроорганизмов - продуцентов аспартазы с последующим выделением аспартазы из клеток, иммобилизацией фермента на ионообменниках и пропусканием через них водного раствора фумарата аммония. Недостатком этого способа является необходимость выделения фермента из клеток и быстрое снижение активности L -аспарагиновой кислот Известен также способ получения L -аспарагиновой кислоты путем культивирования продуцирующих ее микроорганизмов вида Esche.HcH-ia соБ( на питательной среде, отделения суспензии клеток от культуральной жидкости, промывки, иммобилизации клеток путем включения их в полиакР21ламидный гель, измельчения геля, активации клеток и промывки их фума ратом аммония,- Этот способ является наиболее близким к предлагаемому -по технической сущности и достигаемому результату. Недостатком известного способа является его длительность и недостаточная эффективность за счет снижения активности аспартаэы при иммобилизации клеток. Цель изобретения - ускорить процесс и повысить его эффективность. Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения L -аспарагиновой. кислоты в качестве микроорганизмов из вида Eechei tch ia coEi используют штамм Escherichiа 83 или Escher-ichia coEi AH 52, или Escherichi о coSi 85, при этом активацию клеток осуществляют после

отделения их от культуралыюй жидкости путем1 нагревания суспензии клеток при 45-55с в течение 40-60 мин, а .иммобилизацию -проводят в присутствии одной из солей аспарагиновой кислоты в количестве 3-9% по весу с последующим охлаждением смеси до 0-10°С при одновременном воздействии светом видимой области с интенсивностью 15-20 тыс.люкс в течение 510 мин.

Способ осуществляют следующим образом.

Продуцирующие L -аспарагиновую кислоту микроорганизмы вида Esche ricbia co6i штаммы Ah 52, 83 или 85 культивируют 6 ч на питательной среде (МПБ) при 30-37°С, затем клетки отделяют,активируют их нагреванием при 45-55с, преимущественно при ., в течение 40-60 мин и далее промывают.

Последующую иммобилизацию проводят в присутствии одной из солей

Показатель

Длительность процесса, ч

Удельная активность аспартазы,включенных

в гель нативных , клеток,

Eschenichia co6i ед.

активности

Удельная активность аспартазы иммобилизированных нативных клеток Eschenichia coEi , % от свободных клеток

Удельная активность аспартазы включенных активированньис клеток EschePich4a coEi,

Результаты таблицы показывают, что уменьшение времени культивирования микроорганизмов - продуцентов аспартазы и времени активации сокращает длительность процесса примерно в 8 раз.

Пример, односутрчные клетк Eschef chia co8i штамм В o влвaют с поверхности мясо-пептонного агара (МПА) 1-2 мл жидкой стерильной среды и с помощью стерильной пипетки переносят в посевную жидкую стерильную

аспарагиновой, кислоты в количестве 3-9 Еес,% и смеси,содержащей вес.%: акриламид 10-20, метиленбисакриламид 0,33-0,66;N,N,N; N -тетраметилэТилендиамин 0,00025-0,0005; персульфат аммония 0,0375; .рибофлавин

0,005. Клетки вместе со смесью освещают светом видимой области с интенсивностью 15-20 тыс.люкс с одновременным охлаждением до 0-10®С в течение 5-1-0 мин.

Затем гель измельчают и пропускают через него водный раствор фумарата аммония со скоростью злюции 0,5-1,0. при 25-37 с.

Получают чистый продукт с выходом 88-95% потребленного фумарата.

Продукт кристаллизуют подкислением раствора до рН 2,5-3,0, кристаллы отделяют фильтрованием, осадок промрлвают этиловым спиртом и высушивают

на воздухе.

Данные сравнительных испытаний по предлагаемому способу и известному (контроль) приведены в таблице.

Предлагаемый способ

74

187

13,1

77

173

среду того же состава.Культуру вырщивают 12-18 ч глубинным способом при ЗО-ЗБ С в качалочных колбах 750 мл (объем среды 50 мл).

Затем посевной материал в количестве 2-3% вносят в среду того же состава и выращивают тем же способом 6 ч в аналогичных условиях в качалочных колбах с Ьбьемом среды по 125 мл. Клетки отделяют от среды на центрифуге С-44. Из 4 л среды получают 50 мл исходной суспензии клеток E5cher chta coEi штам;. В, которые содержат 56, 92 мг белка в 1 мл (определение по методу Лоури и имеют удельную и общую аспартазну активность, соответственно равные 57 ед на 1 мг белка за 1 ч и 161500 ед (1 ед равна 1 микромолю образованной, аспарагиновой кислоты на 1 мг белка за 1 ч). После трехкратной промывки суспе зии клеток порциями по 230 мл стери ной водопроводной водаа или 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,0 последующего центрифугирования в течение 10 мин при б тыс об/мин получают 50 мл промытой суспензии клеток ЕесЬ pia coEi штамм В с содержанием белка 29,70 мг в 1 мл и удельной и общей активностью, равной соответственно 180 ед на 1 мг белка за 1 ч и 154850 ея. Аспартазную активность свободных клеток определяют следующим образом К 1,7 МП суспензии клеток добавл ют 13 мл 0,1 М фосфатного буфера с pri 8,0 и 15 мл 1 М 11,6%) раство фумарата агфюния, приготовленного добавлением к 116 г фумаровой кисло ты концентрированного раствора амми ака до рН 8,5 и воды до 1 л. В 1 М раствор фумарата аммония вводят хлористый магний в количестве 0,001 (0,002032%). К реакционной смеси добавляют 0,3 мл толуола. Реакционн смесь инкубируют при постоянном пер мешивании при 37°С, отбирая аликвоты по 3 мл через 30 мин в течение 2 ч. Реакцию в аликвотах останавливают, отделяя клетки бактерий центрифугиро ванием в течение 10 мин при Ютыс. об/мин. В надсадочной жидкости опре деляют содержание фумаровой кислоты по поглощению при 240 нм и аспарагиновой кислоты нингидриноБЫМ методом по общепринятой методике. При включении клеток Escher-ich a coBi в полиакриламидный гель к 2,0 мл 50%-ного раствора акриламнда добавляют 1,1 мл 3%-ного раствора метиленбисакриламида, 0,1 мл О,025%-ного раствора рибофлавина, 0,1 мл 0,1875%-ного раствора персульфата аммония, 0,1 мл 5%-ного раствораN,N,N; М -тетраметилэтил ендиаМина, 150 мг дикалиевой соли аспарагиновой кислоты и 1,7 мл суспензии отмытых от балластных белков клеток Escherich co6i штамм В содержащих 80,7& мг белка и имеющих удельную и общую аспартаэную активность, соответственно равные 108 ед. на 1 мг белка за 1 ч и 9500 ед. Смес быстро перемешивают, ставят в чзтакан со льдом и водой и освещают лампой 300 вТ, помещенной на расстоянии 14 см ,в течение 5-10 мин. Блок полиакриламидного геля с включенными в него клетками бактерий 16 весом 6 г растирают в ступке 2 ми;;, получая частицы геля размером от 0,2 до 2,0 мм, Нх отмывают от свободных клеток микроорганизмов, добавляют последовательно четыре раза по 30 мл дистиллированной воды и отделяют промывные воды декантацией после отстаивания осадка 5 мин. Промывные воды собирают вместе, получая 90 мл с -общим содержанием белка 33,0 MFf т.е. 41% от внесенного 5 оличества. В полиакриламидный гель включены клетки Eschenichia coSi штамм В в количестве, соответствующем 47,87 мг белка или 59%. Удельная активность иммобилизованных клеток повышается до 187 ед;-на 1 мг белка за 1 ч, общая активность равна 950 ед., что составляет 94,5% от внесенной общей активности. Объем суспензии частиц полиакриламйдного геля, равный 15 мл, с включенными клетками Eschernclua coEi штамм В после последнего промывания количественно переносят в 15 мл 1 М (11,6%) раствора фумаратг аммония, приготовленного, как указано выше с 0,3 мл. толуола. Реакционную смесь выдерживают при З7с при постоянном перемешивании и через 30 мин в течение 2 ч отбирают аликвоты по 5 мл. Реакцию в аликвотак останавливают фильтрованием через бумажный ;уфильтр частиц геля с включенными клетками бактерий. В фильтрате определяют содержание фумаровой и аспарагиноэой кислот методом, описанным выше. Во всех случаях проводят идентификацию образовавшейся аспарагиновой кислоты при помсмци тонкослойной хроматографии на пластинках Силуфол в системах растворителей хлороформметаноламмиак- вода в соотношении 40:40:7:3 и на пластинках .Фиксиом при использовании 0,4 М цитратного буфера рН 3,3. Стандартом служит L -аспарагиновая кислота хроматографически чистая фиргж Реанол (ВНР) . Приготавливают три одинаковых образца полиакрила1мидного геля с включенными в него клетками Е.coBi штамм 83, отличие мезвду которыми состоит только в том, что полимеризацию одного геля проводят.обычным способом при освещении светом видимой области с интенсивностью 1520 тыс.люкс и при охлаждении в стакане с водой и льдом, второй освещают в воде при комнатной температуре, а в третьем проводят полимеризацию без освещения и при охлаждении. Иммобилизованные при освещении и охлаждении до 8с клетки E, 83 имеют удельную и общую аспартазт ную активность, соответственно равные 187 ед. на 1 мг белка за 1 ч и 8950 ед. (94,5% от внесенной), при освещении без охлаждения, соответственно равные 21,6 ед. на 1 мг белка 7 за 1 ч к 1100.ед, (16,55 от BViecsH ной) , а без освещения - 5 ед, па 1 мг белка .за 1 ч к 230 ел, (3, внесенной) и полниеризация Б зто случае протекает 60 мик. П р и м е р 2., штамм АН 52 выращивают, н готовят суспензию согласно примеру .1,. Содержание белка равно 39f368 мг в 1, мл суспензии клеток, удельная а.ктивность - 25 ед, на 1 мг белка за 1 ч. Иммобилизацию клеток бактерий проводят., как в примере 1, в двух одинаковых образцах, внося в каждый по 67,5 мг белка с общей активностью аспартазы 1685 ед, От личие между образцами состоит в том, что в одном случае в смесь для фотополимеризации полиакрилакидаю го геля добавляют 150 мг дикалиевой соли5аспара1 яковай кислоты, а Е другом не добавляют. Аспартазную актиг ность включенных в полиакриламидный гель клеток бактерий определяютf как в примере Клетки бактерий, иммобилизованны в присутствии соли аспарагиновой кислоты, имеют удельную и общую активность срответствекно 74,0 ед. .на 1 мг белка за 1 ч и 3530.ед,, т..е.. 210% от исходной; без соли аспарагиновой кислоты соответственн 2,58 ед. на 1 мг белка за 1 ч и 130 ед., т.е. 8,7% от исходной обще активности. Примерз, Клетки -EvCpEJ штамм Кр выращивают, как з примере 40 мл суспензии непромытых клеток е содержанием белка 57,0 мг в 1.мл удельной активностью 57 ед, на 1 мг белка за 1 ч разделяют на две равны дозы, 20 мл этой суспензии промываю от балластных белков, как в. примере и получают 20 мл суспензии клеток .бактерий с обозначением нативныя и содерлсанием белка 29,7 мг в 1 мл Другие 20 мл суспен.зии неотмытых бактериальных клеток вначале нагре.вают 40 мин при , а затем oTivibiв.ают от балластных белков, как в пр мере 1, 20 мл суспензии : клеток с обозначением активирован ных С содержанием белка 27,06 мг в 1 мл. Включение бактериальных кле в полиакриламидный .гель осуществляю как в примере 1. . Затем определяют;аспартазную ак ность, свободных и включенных,в.; полиакриламидный гель нативньк и активированных клеток Е-соВ штамм Кр, как в примере 1. Полу1аю свободные и иммобилизованные нз,тивные клетки E.coEi Кр с уде ной аспартазной , активностью, соот-ветственно равной 108 и 187 ед. на 1 м.г белка за 1 ч, а также свободн и иммобилизованные активированны клетки . соВ4 Кр с удельной ас .:1о, соответственно ед., на 1 мг белка U р и .: е р 4, К.гетки Е.со2| та;.а/ Кр выращива;от, как в примере 1, 10 мл суспе-зии клеток нагревают 10 vjii до 50°С, а затем отмывают l балластных , как в примере 1. получая 10 мл суспензии актиБЗчрсЕапиых клеток содерлсащих 35,2 мгм .;ел;-;а в 1 мл и имеющих удельную акТ;-:БНОСТЬ аспсштазы 27,8 ед.на 1 мг белка за 1 ч, 5,1 MJI этой суспензии с сояержан1-5ем 179 мг белка с общей аспартазной активностью 4999 ед. добавл.чют к тройному количеству всех составных частей для фотополимеризации полиакркламидного геля, указанных в - примере 1. У1:;лоБИ5т фото к л ;-тмеризации и измельчения полиакриламидного геля,, как s 1, Часгицы измельченного 1еля промьвают 4 раза порциями Of 01 М фосфатного буфера рЫ 7,0 по .50 MJ; и собирают 150 мл промывных BCvi , которые содержат 69мг б.елка и 1940. ед общей актнвности аспартаВ полиакриламидмый гель включают. j-:j.r.ei. , сой Кр, количество кото:рь;х соответствует 110 мг белка или GljO-J исходного количества. ВключенHi:.;e в гель клетки имеют удельную аспаотазкуш активность 119 -ед. на )- ivii ;3с,:-:ч. за 1 .ч и общую 13200 ед. (263 о-г рлшсенной) , Все полученное 1:ол-ГчестЕО частиц полиакриламидного rajrw с вклю-ч:екиьГ.1и в него-клетками; Е, coEj Кр переносят в колонку 1,. 8x7,5 см к объемом 19,1 см. Через колонку термостатированную при пропускают 1 л 1 М раствора фумарата а -1мания, приготовленного, как в npravtepc 1, со скоростью 10 мл/ч, что соответствует удельной скорости элютки 0,525, Собирают 1 л элюата, з ко :ором содер к 1ние аспарагиновой ;:ислоаы равно 0,865 М, а фумаровой 0,012 М, .Tie молярный выход образоЕэ.в.шейся аспарагиновой кислоты по отношению к потребленному фумарату равен 88%. К 1 л элюата добавляют концентрированную серную кцслоту до рН 3,0, выпавший обильный осадок о.тделяют фильтро.ванием, промывают последовательно двумя порциями холодной воды до 50 мл и 50 мл 96%-ного этилового спирта и сушат до постоянного веса на воздухе, получая 110 г аспарагиновой кислоты, которая в б г НС8имеет (а)| +25,. Это указывает на 100%-ное содержание L -формы в целевом продукте. В целевом продукте не обнаруживают фумс1ровой кислоты - исходного сырья. Полученная L -аспарагиновая KiscjpTa дает одно пятно при хроматографировании на пластинках

Силуфол и Фиксион, как указано в примере 1, и один пик на аминокислотном анализаторе фирмы Хитачи (Япония), точно соответствующий стандартной L -аспарагиновой кислоте. Целевой продукт не загрязнен клетками микроорганизмов. Элементарный микроанализ содержит,%:s 4,90% Н, 36,48% С, 10,49%N, что соответствует теоретическому содержанию этих элементов в аспарагиновой кислоте (5,301% И; 36,.0-95% С; 10,52%N),

Предлагаемый способ:получения Lаспарагиновой кислоты по сравнению с известным техническим решением той же задачи обеспечивает повышение эффективности процесса за счет сокращения времени активации клеток микроорганизмов и .повышения их активности перед иь«мобилизацией, а также увеличения скорости элюции исходного- сырья через колонку.

Формула изобретения

Способ получения L -аспарагиновой кислоты путем культивирования пррдуЦирующих ее микроорганизмов вида EscheгiCh O( Co6i на питательной среде, отделения суспензии клеток от культуральной жидкости,промывки, иммобилизации клеток путем включения их в полиакриламидный гель, измельчения геля, активации клеток и промывки их фумаратом аммония, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса и повышения его эффективности, в качестве микроорганизмов из вида Escher chia coEi используют штаммы Eschepichia со6 83 или Escher( coBi АН 52, или EscherMchia coEj 85, при этом активацию клеток осуществляют после отделения их от культуральной жидкости путем нагревания суспензии клеток при 45-55°С в течение 4060 мин, а иммобилизацг1ю проводят в присутствии одной из солей аспарагиновой кислоты в количестве 3-9 вес.% с последующим охлаждением смеси до при одновременном воздействии светом видимой области с интенсивностью 15-20 тыс.люкс в течение 5-10 мин.