СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОКАТАЛИЗАТОРА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ СИНТЕЗА ЦЕФАЛОСПОРИНОВ-КИСЛОТ Российский патент 2011 года по МПК C12N11/04 

Заявляемое изобретение относится к получению гетерогенных биокатализаторов (БК) на основе бактериальных клеток, а именно биокатализатора на основе клеток Esherichia coli, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот.

Известен способ иммобилизации клеток E.coli, обладающих пенициллинацилазной активностью, состоящий во включении сшитых глутаровым альдегидом клеток со специально повышенной проницаемостью клеточных стенок в пористые сферические шарики полиакриламидного геля [1]. При получении шариков геля полимеризацию инициируют окислительно-восстановительной парой, в которой катализатором процесса служит N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин, а инициатором - персульфат аммония [2]. Получают биокатализатор, предназначенный для ферментативного гидролитического расщепления бензилпенициллина (БП) с целью производства 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК). Его ферментативная активность по гидролизу БП очень низка - менее 8 МЕ/г¹ (¹ За международную единицу (ME) ферментативной активности препарата в отношении какой-либо биокаталитической трансформации принимают такое количество этого препарата, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата (или образование 1 мкмоля продукта) в выбранных условиях за 1 минуту).

Известен способ иммобилизации микробных клеток, в том числе клеток E.coli, путем их ковалентного присоединения к активным группам сшитых полимеров (гелей), получаемых путем сополимеризации различных мономеров, в основном акрилатной природы [3]. При этом клетки приводят в контакт либо с уже готовым полимером, либо с мономерами, которые затем подвергают полимеризации. До контакта с полимером или мономерами клетки могут быть обработаны полифункциональным сшивающим агентом, в том числе глутаровым альдегидом. Полимеризацию мономеров инициируют парой бета-диметиламинопропионитрил - персульфат аммония. Данный патент не содержит примеров получения биокатализатора на основе клеток E.coli, однако описаны способы иммобилизации клеток Proteus rettgeri, содержащих пенициллинацилазу, с целью получения биокатализаторов для получения 6-АПК ферментативным гидролизом БП. Даже лучший из описанных биокатализаторов обладает очень низкой операционной стабильностью, характеризующейся двукратным падением активности за 20 циклов использования в процессе гидролиза БП, что соответствует 60 часам.

Наиболее близким к заявляемому способу получения биокатализатора на основе иммобилизованных клеток E.coli является способ получения биокатализатора для гидролитического расщепления БП, осуществляемый путем включения в полиакриламидный гель клеток E.coli, содержащих пенициллинамидазу (пенициллинамидогидролазу) [4]. Согласно ближайшему аналогу процедура получения биокатализатора состоит в следующем. Глубинное культивирование штамма E.coli АТСС 9637 осуществляют при 30°C на среде, содержащей органические источники углерода и азота, а также неорганические соли. Процесс биосинтеза проводят в течение 24 часов; использование каких-либо специальных критериев для выбора момента остановки биосинтеза не описано. Выращенную биомассу клеток суспендируют в растворе мономеров полиакриламидного геля (акриламид и N,N'-метиленбисакриламид) и проводят процесс гелеобразования, добавляя в реакционную смесь катализатор полимеризации (бета-диметиламинопропионитрил) и ее инициатор (персульфат калия). Биомассу клеток используют в количестве, необходимом для создания ее концентрации в полимеризационной смеси (п.см) С_БМК=33 мг сух./г п.см. Полученный гель измельчают и промывают.

Основными недостатками способа согласно ближайшему аналогу являются отсутствие ковалентной фиксации клеток при иммобилизации, влекущее за собой возможность загрязнения целевого продукта ферментативной трансформации примесями органической природы, в первую очередь белками, вымываемыми из биокатализатора, а также низкая активность иммобилизованных по этому способу клеток. Так, биокатализатор, получаемый согласно ближайшему аналогу, в отношении гидролиза БП имеет активность лишь 22 МЕ/г; его активность в отношении синтеза бета-лактамных антибиотиков, в частности в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот, не контролировалась.

Воспроизведение способа иммобилизации клеток согласно ближайшему аналогу (Пример 3) с использованием штамма E.coli VKPM В-10182, продуцирующего синтетазу цефалоспоринов-кислот, позволило получить биокатализатор, обладающий активностью по синтезу цефазолина около 40 МЕ/г влажн. (300 МЕ/г сух.) при выходе активности процесса иммобилизации 50%. Низкая активность такого биокатализатора не позволяет использовать его для синтеза цефалоспоринов-кислот в реакторе периодического действия с перемешиванием. Так, для процесса синтеза цефазолина в таком реакторе необходим биокатализатор с активностью не ниже 60 МЕ/г влажн., 330 МЕ/г сух. Стабильность биокатализатора, полученного согласно прототипу, тоже низка. В условиях ускоренной инактивации (40°C, рН 6,5) период его полуинактивации составляет всего 20 часов, что является результатом не только термической инактивации фермента, но и его физического вымывания из гелевой матрицы. Потери синтетазной активности при однократной промывке биокатализатора 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,5 в мягких условиях (1 г влажного БК в 3 мл буфера, 20°C, 1 час) составляют около 30%. Наблюдается вымывание белка в надосадочную жидкость в количестве 5 мг с 1 г БК. Неизбежное загрязнение целевого продукта процесса биокаталитической трансформации веществами белковой природы делает невозможным использование такого биокатализатора для производства антибиотиков.

Задача заявляемого изобретения состоит в разработке способа получения биокатализатора на основе клеток Escherichia coli, иммобилизованных в полиакриламидном геле, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот, характеризующегося высокими активностью и стабильностью и не содержащего слабо связанных белков, способных загрязнять целевой продукт биокаталитической трансформации.

Поставленную задачу решают путем совокупного использования в процессе получения биокатализатора ряда приемов, осуществляемых в выбранных оптимизированных условиях.

Согласно заявляемому способу исходным материалом для получения биокатализатора служит штамм E.coli, продуцирующий фермент синтетазу цефалоспоринов-кислот. Культивирование данного продуцента осуществляют на жидкой ферментационной среде, содержащей органические источники углерода и азота. В качестве критерия остановки процесса используют константу распределения целевого фермента между биомассой клеток (БМК) и внешним раствором К_расп, характеризующую прочность связывания фермента с клеточными структурами. Выращенную биомассу клеток суспендируют в растворе мономеров полиакриламидного геля, модифицируют глутаровым альдегидом, а затем добавляют инициатор полимеризации - соль надсерной кислоты. Внесение в реакционную смесь катализатора полимеризации не требуется. Полученный гель измельчают и отмывают от не связавшихся в процессе полимеризации веществ (белки, мономеры).

Процесс биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот останавливают в фазе стационарного роста клеток E.coli при константе распределения синтетазы цефалоспоринов-кислот К_расп≥350 и значении рН культуральной жидкости 7,9÷8,2. Временные рамки наступления выбранного оптимального для иммобилизации состояния клеток могут сдвигаться в зависимости от используемого штамма E.coli, что влияет на продолжительность биосинтеза (см. Таблицу 1 в Примере 4). Получаемые в выбранных условиях клетки сочетают высокую активность по целевому ферменту (не менее 1600 МЕ/г сух.) и прочное связывание синтетазы цефалоспоринов-кислот клеточными структурами, остающимися в стационарной фазе интактными. Сохранение естественного клеточного микроокружения целевого фермента предохраняет его от неблагоприятных воздействий процессов иммобилизации и последующей эксплуатации биокатализатора, поэтому иммобилизация клеток E.coli с K_paсп≥350 обеспечивает получение биокатализатора с высокой активностью по синтезу цефалоспоринов-кислот и хорошей стабильностью. При рН культуральной жидкости ниже 7,9 синтетаза цефалоспоринов-кислот прочно связана с клеточными структурами (K_расп≥350), однако использование таких клеток для иммобилизации нецелесообразно из-за недостаточно высокой активности получаемой биомассы клеток. Использование для иммобилизации клеток со слабо связанным целевым ферментом (К_расп<350, рН>8,2), находящихся в состоянии ограниченного цитолиза (разрушение цитоплазмы клеток) или следующего за ним автолиза (разрушение цитоплазмы и клеточных мембран), приводит к снижению стабильности биокатализатора, а также потерям активности в процессе иммобилизации (Пример 5).

Использование высоких концентраций биомассы клеток (густоты клеточной суспензии) C_БМК=100÷150 мг сух./г п.см. (в 3-5 раз выше, чем в методе согласно ближайшему аналогу) позволяет получать высокоактивный биокатализатор, благодаря введению в полимеризационную смесь большого количества активных клеток. Последующая модификация глутаровым альдегидом предотвращает их вымывание из геля в процессе получения и отмывки биокатализатора. Верхний предел густоты клеточной суспензии (150 мг сух./г п.см.) ограничен возможностью внесения в полимеризационную смесь влажной БМК с содержание сухих веществ 20-23% в количестве не более 70% от ее общего веса (W_п.см). Использование густоты суспензии менее 100 мг сух./г п.см. не обеспечивает получение биокатализатора с достаточно высокой активностью (см. Таблицу 2 в Примере 6).

Модификация клеток глутаровым альдегидом при осуществлении заявляемого способа имеет два положительных последствия. Во-первых, это приводит к необратимой фиксации в биокатализаторе белкового содержимого клеток, включая целевой фермент. Результатом являются повышение активности и стабильности иммобилизованных клеток, а также отсутствие вымывания белков из готового биокатализатора. Во-вторых, промежуточные продукты взаимодействия глутарового альдегида с белками выступают катализаторами процесса полимеризации мономеров полиакриламидного геля, что делает ненужным внесение в реакционную смесь обычно используемых для этой цели веществ (бета-диметиламинопропионитрил или N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин). Возможность такой замены была продемонстрирована ранее при иммобилизации свободных белков в акрилатных гелях [5]. Согласно заявляемому способу глутаровый альдегид используют в относительной концентрации С_ГА=1·10^-3÷9·10^-3 ммоль/мг белка, проводя модификацию в течение τ_мод=5÷30 мин. Использование модификатора в концентрации выше 9·10^-3 ммоль/мг белка приводит к получению недостаточно активного биокатализатора, а при концентрации глутарового альдегида ниже 1·10^-3 ммоль/мг белка и/или времени модификации меньше 5 мин снижается стабильность биокатализатора и возникает возможность вымывания из него белков. При времени модификации глутаровым альдегидом больше 30 мин в реакционной смеси снижается концентрация промежуточных продуктов взаимодействия белков с глутаровым альдегидом, являющихся катализаторами полимеризации акрилатных мономеров, поэтому последующий процесс гелеобразования протекает медленно, а механические свойства получаемого биокатализатора ухудшаются (см. Таблицу 3 в Примере 7).

Способ в общем виде

Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот осуществляют путем культивирования штамма E.coli, продуцирующего соответствующий фермент, на жидкой ферментационной среде следующего состава (мас.%): кукурузный экстракт (2% по сухому весу) и тиофен-2-уксусная кислота (0,1%). Ферментацию останавливают при константе связывания целевого фермента К_расп≥350 и значении рН культуральной жидкости в диапазоне 7,9÷8,2. Выращенную клеточную биомассу отделяют центрифугированием (5-8 тыс. об/мин), промывают 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,5 и вновь отделяют центрифугированием в тех же условиях. Осадок, представляющий собой биомассу клеток (БМК), используют для иммобилизации путем включения модифицированных клеток в полиакриламидный гель, получаемый сополимеризацией акриламида (АА) и N.N'-метилен-бис-акриламида (БИС).

Биомассу клеток, взятую из расчета С_БМК=100÷150 мг сух./г п.см., суспендируют в фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем мономеры полиакриламидного геля в весовом соотношении АА:БИС=20:1 при общей их концентрации в полимеризационной смеси C_мoн=9%. При постоянном перемешивании и охлаждении клеточной суспензии на ледяной бане проводят модификацию клеток глутаровым альдегидом, взятым в относительной концентрации C_ГА=1·10^-3÷9·10^-3 ммоль/мг белка, содержащимся в клетках. Время модификации глутаровым альдегидом τ_мод=5÷30 мин. По окончании модификации в реакционную смесь вносят инициатор полимеризации - соль надсерной кислоты, например персульфат аммония или персульфат калия, в концентрации, необходимой для осуществления гелеобразования в течение 20-120 сек. Полученный блок геля выдерживают на холоду еще 20-30 мин, а затем измельчают, дважды продавливая сквозь металлическое сито с размером ячеек 0,5 мм, и отмывают от не связавшихся в процессе полимеризации веществ. Иммобилизованные клетки отделяют от промывных вод вакуумной фильтрацией на пористом стеклянном фильтре. Получают биокатализатор с активностью в отношении синтеза цефазолина не менее 100 МЕ/г влажн., 600 МЕ/г сух., периодом полуинактивации (τ_1/2) не менее 800 часов (40°C и рН 6,5). Биокатализатор устойчив в отношении вымывания из него веществ белковой природы и может быть использован в процессах синтеза цефалоспоринов-кислот в реакторах периодического действия с перемешиванием.

Заявляемый способ получения биокатализатора на основе иммобилизованных в полиакриламидном геле клеток штаммов E.coli, продуцирующих синтетазу цефалоспоринов-кислот (Примеры 1, 2, 6, 7), имеет ряд преимуществ по сравнению с контролем - способом, выполненным согласно ближайшему аналогу и осуществленным с использованием культуры E.coli, штамм VKPM В-10182 (Пример 3):

- повышение активности получаемого биокатализатора в отношении синтеза цефазолина в 2-3 раза (600÷950 МЕ/г сух. по заявляемому способу и 300 МЕ/г сух. согласно контролю);

- повышение стабильности получаемого биокатализатора в условиях ускоренной инактивации не менее чем в 40 раз (τ_1/2=800-2000 час по заявляемому способу и τ_1/2=20 час согласно контролю);

- отсутствие вымывания целевого фермента и других белков из биокатализатора, полученного согласно заявляемому способу, в отличие от биокатализатора, полученного согласно ближайшему аналогу.

Изобретение проиллюстрировано следующими примерами осуществления способа получения биокатализатора с использованием двух штаммов E.coli, продуцирующих синтетазу цефалоспоринов-кислот, а именно VKPM В-10182 из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (VKPM) и CGMCC No.3508 из Китайской Коллекции Культур Микроорганизмов (CGMCC).

Во всех приведенных примерах приведена активность ферментных препаратов по синтезу цефалоспорина-кислоты цефазолина из 3-метил-меркапто-5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил-7-аминоцефалоспорановой кислоты (ММТД-7-АЦК) и метилового эфира 1(Н)-теразолилуксусной кислоты (МЭТЗУК). Ее определяют по начальной скорости образования цефазолина в следующих условиях: рН 7,5, температура (30±1)°C, концентрации субстратов - (0,059±0,002) моль/л ММТД-7-АЦК и (0,23 6±0,004) моль/л МЭТЗУК. Содержание цефазолина в реакционной смеси определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Содержание сухих веществ в биомассе клеток и биокатализаторах определяют весовым методом после высушивания препарата при (105±1)°C до постоянной массы.

Константу распределения синтетазы цефалоспоринов-кислот (К_расп) между биомассой клеток и внешним раствором определяют путем анализа ферментативной активности биомассы клеток (А_БМК, МЕ/г влажн.) и надосадочной жидкости (А_р-р, МЕ/мл) после суспендирования 1 г влажной БМК в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 6,5 и рассчитывают по формуле: К_расп=А_БМК/А_р-р.

Содержание белка в биомассе клеток и растворах определяют методом Лоури [6]. За динамикой инактивации биокатализаторов следят, контролируя их остаточную активность после инкубации в течение различного времени в условиях ускоренной инактивации при 40°C и рН 6,5 в 0,1 М фосфатном буфере. Стабильность образцов характеризуют по времени их полуинактивации в данных условиях (τ_1/2, час).

Потери белков и целевого фермента при промывке биокатализаторов контролируют путем определения содержание белков и определения синтетазной активности в надосадочной жидкости после суспендирования 1 г влажного биокатализатора в 3 мл 0,1 М фосфатного буфера при рН 7,5 в течение 1 часа при 20°C.

Пример 1. Осуществление заявляемого способа получения биокатализатора с использованием культуры E.coli, штамм VKPM В-10182

Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coli VKPM В-10182 проводят в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащих по 100 мл ферментационной среды следующего состава:

- кукурузный экстракт - 2% (на сухой вес)

- тиофен-2-уксусная кислота - 0,1%

- вода водопроводная - до нужного объема.

рН после стерилизации 6,9-7,1.

Культивирование продуцента фермента ведут при температуре 25-26°C на круговой качалке со скоростью вращения 220-240 об/мин. Процесс биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот проводят в течение 18 часов и останавливают при рН 8,1, К_расп=380. Выращенную биомассу клеток отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге с охлаждением, промывают 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,5 и повторно отделяют центрифугированием в тех же условиях.

С 3,70 л культуральной жидкости получают 46,6 г влажной биомассы клеток E.coli, содержащей синтетазу цефалоспоринов-кислот и характеризующейся следующими показателями качества:

- синтетазная активность (А_БМК) - 460 МЕ/г влажн.; 2009 МЕ/г сух.;

- содержание сухих веществ (β_БМК) - 22,9%;

- содержание белка - 114 мг/г влажн.

Полученную биомассу клеток E.coli, штамм VKPM В-10182, используют для иммобилизации путем включения в полиакриламидный гель.

Иммобилизацию биомассы клеток осуществляют в следующих условиях:

W_{п. см}=7,0 г; С_БМК=37 мг сух./г п.см; С_ГА=1,7·10^-3 ммоль/мг белка; τ_мод=15 мин; С_мон=9%; инициатор полимеризации персульфат аммония - 0,2%.

Процедуру проводят в стеклянном стакане, помещенном на магнитную мешалку в ледяную баню. 4,2 г влажной биомассы клеток суспендируют в 1,4 мл 0,3 М фосфатного буфера с рН 7,5, затем добавляют 1,05 мл 60% водного раствора мономеров акриламидного геля (АА:БИС=20:1). После получения однородной суспензии в нее вносят 0,32 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и осуществляют модификацию белков сшивающим агентом в течение 15 мин при постоянном перемешивании. Затем к полимеризационной смеси при интенсивном перемешивании добавляют 0,06 мл (60 мкл) 25% водного раствора персульфата аммония и останавливают мешалку. Через 30 секунд образуется гель, который выдерживают на ледяной бане 20 мин, измельчают последовательным двукратным продавливанием через металлическое сито с размером ячеек 0,50 мм и отмывают дистиллированной водой и 1 М водным раствором хлористого натра. Биокатализатор отделяют от промывных вод вакуумной фильтрацией.

Получают 7,01 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:

- синтетазная активность (А_БК) - 165 МЕ/г влажн.; 900 МЕ/г сух.;

- содержание сухих веществ (β_БК) - 18,3%;

- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ_1/2) - 1200 час.

Выход активности процесса иммобилизации - 59,9%.

Потери при промывке готового биокатализатора буфером:

- синтетазная активность - не обнаружено

- белок - не обнаружено.

Пример 2. Осуществление заявляемого способа получения биокатализатора с использованием культуры Е. соli, штамм CGMCC No.3508

Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coli, штамм CGMCC No.3508, осуществляют, как описано в примере 1 для штамма E.coli VKPM В-10182, с той лишь разницей, что процесс биосинтеза фермента проводят в течение 16 часов и останавливают при рН 8,05, К_расп=370. Выращенную биомассу клеток отделяют и отмывают в соответствии с описанием, приведенным в примере 1.

С 1,2 л культуральной жидкости получают 13,1 г влажной биомассы клеток E.coli, содержащей синтетазу цефалоспоринов-кислот и характеризующейся следующими показателями качества:

- синтетазная активность (А_БМК) - 380 ME/г влажн.; 1820 МЕ/г сух.;

- содержание сухих веществ (β_БМК) - 23,0%;

- содержание белка - 90 мг/г влажн.

Полученную биомассу клеток E.coli, штамм CGMCC No.3508, используют для иммобилизации путем включения в полиакриламидный гель.

Иммобилизацию проводят в следующих условиях:

W_п.cм=7,0 г; С_БМК=145 мг сух./г п.см; С_ГА=5,0·10^-3 ммоль/мг белка; τ_мод=10 мин; С_мон=9%; инициатор полимеризации персульфат аммония - 0,2%.

Процедуру проводят в стеклянном стакане, помещенном на магнитную мешалку в ледяную баню. 4,4 г влажной биомассы клеток суспендируют в 0,7 мл 0,3 М фосфатного буфера с рН 7,5, затем добавляют 1,05 мл 60% водного раствора мономеров акриламидного геля (АА:БИС=20:1). После получения однородной суспензии в нее вносят 0,79 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и осуществляют модификацию белков сшивающим агентом в течение 10 мин при постоянном перемешивании. Затем к полимеризационной смеси при интенсивном перемешивании добавляют 0,06 мл (60 мкл) 25% водного раствора персульфата аммония и останавливают мешалку. Через 20 секунд образуется гель, который выдерживают на ледяной бане 20 мин, измельчают последовательным двукратным продавливанием через металлическое сито с размером ячеек 0,50 мм и отмывают дистиллированной водой и 1 М водным раствором хлористого натра. Биокатализатор отделяют от промывных вод вакуумной фильтрацией.

Получают 6,95 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:

- синтетазная активность (А_БК) - 150 МЕ/г влажн.; 840 МЕ/г сух.;

- содержание сухих веществ (β_БК) - 17,8%;

- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ_1/2) - 1250 час.

Выход активности процесса иммобилизации - 62,4%.

Потери при промывке готового биокатализатора буфером:

- синтетазная активность - не обнаружено

- белок - не обнаружено.

Пример 3. Осуществление способа получения биокатализатора согласно ближайшему аналогу с использованием культуры E.coli, штамм VKPM В-10182, (контроль)

Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coli, штамм VKPM В-10182, отделение и отмывку биомассы клеток осуществляют согласно примеру 1. Полученную биомассу клеток, охарактеризованную в примере 1, используют для иммобилизации путем включения в полиакриламидный гель согласно процедуре, описанной в ближайшем аналоге.

Иммобилизацию биомассы клеток осуществляют в следующих условиях:

W_п.см=7,0 г; С_БМК=33 мг сух./г п.см; С_мон=12,7%; катализатор полимеризации бета-диметиламинопропионитрил - 0,36%; инициатор полимеризации персульфат калия - 0,07%.

1,0 г влажной биомассы клеток суспендируют в 4,0 мл 0,9% раствора хлористого натра, затем растворяют в этой суспензии 0,75 г акриламида и 0,40 г N,N'-метилен-бис-акриламида (АА:БИС=18:1). Последовательно вносят по 0,5 мл 5% раствора бета-диметиламинопропионитрила и 1% раствора персульфата калия. Образовавшийся гель выдерживают 20 минут, затем измельчают последовательным двукратным продавливанием через металлическое сито с размером ячеек 0,50 мм и отмывают 0,9% раствора хлористого натра.

Получают 6,20 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:

- синтетазная активность (А_БК) - 38 МЕ/г влажн.; 300 МЕ/г сух.;

- содержание сухих веществ (β_БК) - 12,7%;

- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ_1/2) - 20 час.

Выход активности процесса иммобилизации - 51,4%.

Потери при промывке готового биокатализатора буфером:

- смыв синтетазной активности - 11 ME с 1 г БК (29% от исходной активности БК)

- смыв белка - 5 мг белка с 1 г БК.

Пример 4. Динамика биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coli

Культивирования продуцента E.coli, штамм VKPM В-10182 или CGMCC No.3508, осуществляют в колбах Эрленмейера в условиях согласно примеру 1. По ходу процесса выводят из опыта по две колбы, объединяют содержащуюся в них культуральную жидкость, контролируют в ней значение рН, а затем отделяют биомассу клеток центрифугированием и промывают ее 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,5, используемым в количестве 5 мл на 1 г БМК. Анализируют промывные воды и полученную биомассу клеток и рассчитывают константу распределения синтетазы цефалоспоринов-кислот К_расп. Полученные данные о взаимосвязи рН культуральной жидкости, К_расп и активности получаемой биомассы клеток (А_БМК, МЕ/г сух.) представлены в Таблице 1.

Таблица 1 Динамика биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот Время, час E.coli VKPM B-10182 E.coli CGMCC No.3508 pH А_БМК, МЕ/г сух. К_расп pH А_БМК, МЕ/г сух. К_расп 10 7,61 1490 350 7,55 1250 390 12 7,75 1640 360 7,65 1360 380 14 7,80 1770 370 7,95 1620 410 16 7,92 2140 350 8,05 1840 370 17 8,04 2180 360 8,10 1670 360 18 8,11 2000 380 8,18 1700 400 19 8,13 2060 420 8,28 1650 340 20 8,17 1980 420 8,38 1590 320 21 8,25 1990 340       22 8,32 1980 330       23 8,46 1855 300       24 8,58 1666 290       25 8,70 1600 270       26 8,95 1540 190      

Пример 5. Использование для иммобилизации клеток со слабосвязанным целевым ферментом

Культивирование продуцента синтетазы цефалоспоринов-кислот, отделение и отмывку биомассы клеток осуществляют согласно примеру 1, с той разницей, что процесс биосинтеза фермента проводят в течение 22,5 часов и останавливают при pH 8,38, K_pacп=320.

С 0,70 л культуральной жидкости получают 8,1 г влажной биомассы клеток E.coli VKPM В-10182, содержащей синтетазу цефалоспоринов-кислот и характеризующейся следующими показателями качества:

- синтетазная активность - 440 МЕ/г влажн.; 1900 МЕ/г сух.;

- содержание сухих веществ - 23,2%;

- содержание белка - 95 мг/г влажн.

Полученную биомассу клеток используют для иммобилизации в полиакриламидном геле, осуществляемой в условиях согласно Примеру 1.

Получают 6,91 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:

- синтетазная активность (А_БК) - 113 МЕ/г влажн.; 750 МЕ/г сух.;

- содержание сухих веществ (β_БК) - 15,1%;

- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ_1/2) - 750 час.

Выход активности процесса иммобилизации - 42,2%.

Потери при промывке готового биокатализатора буфером:

- синтетазная активность - не обнаружено

- белок - не обнаружено.

Пример 6. Влияние густоты клеточной суспензии на свойства получаемого биокатализатора

Для иммобилизации используют биомассу клеток E.coli VKPM В-10182, полученную согласно Примеру 1. Процедуру иммобилизации осуществляют в условиях согласно Примеру 1, варьируя содержание биомассы клеток в полимеризационной смеси (густоту клеточной суспензии) при сохранении суммарного объема полимеризационной смеси за счет соответствующего изменения вносимого объема буфера. Для инициирования полимеризации используют различные соли надсерной кислоты. Свойства полученных биокатализаторов представлены в Таблице 2.

Таблица 2 Влияние густоты клеточной суспензии на свойства получаемого биокатализатора № С_БМК, мг сух./г п.см. Инициатор полимеризации β_БК, % А_БК τ_1/2, час МЕ/г влажн. МЕ/г сух. 1 75 (NH₄)₂S₂O₈ 13,0 63 485 - 2 100 K₂S₂O₈ 16,1 108 670 1100 3 (Пример 1) 137 (NH₄)₂S₂O₈ 18,3 165 900 1200 4 150 Na₂S₂O₈ 19,4 185 950 1340

Пример 7. Влияние концентрации глутарового альдегида и времени модификации на свойства получаемого биокатализатора

Для иммобилизации используют биомассу клеток E.coli VKPM В-10182, полученную согласно Примеру 1. Процедуру иммобилизации осуществляют в условиях согласно Примеру 1, варьируя время модификации клеток глутаровым альдегидом, а также его относительную концентрацию (при сохранении суммарного объема полимеризационной смеси за счет соответствующего изменения вносимого объема буфера). Времена гелеобразования (полимеризации, τ_полим, сек) и свойства полученных биокатализаторов представлены в Таблице 3.

Таблица 3 Влияние концентрации глутарового альдегида и времени модификации на свойства получаемого биокатализатора № С_ГА, ммоль/мг белка τ_мод, мин τ_полим, сек β_БК, % А_БК τ_1/2, час Смыв с 1 г БК МЕ/г влажн. МЕ/г сух. ME мг белка 1 0,5·10^-3 15 60 14,1 121 870 500 0,26 0,15 2 1,0·10^-3 30 120 17,0 150 880 810 нет нет 3 1,7·10^-3 1 45 13,8 130 950 620 0,2 0,1 4 (Пример 1) 1,7·10^-3 15 30 18,3 165 900 1200 нет нет 5 1,7·10^-3 45 600 (слабый гель) 6,8 52 760 - - - 6 9,0·10^-3 5 90 19,1 118 620 2000 нет нет 7 14,0·10^-3 15 60 18,7 95 510 2200 нет нет

Таким образом, разработан способ получения биокатализатора, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот, на основе клеток E.coli, иммобилизованных в полиакриламиднрм геле. Способ позволяет получать стабильный биокатализатор с активностью не менее 600 МЕ/г сух., не содержащий слабо связанных белков, способных загрязнять целевой продукт биокаталитической трансформации.

Особенностями способа являются:

- использование штаммов культуры E.coli, продуцирующих фермент синтетазу цефалоспоринов-кислот;

- выбор момента остановки культивирования продуцента при К_расп не менее 350 и значении рН в диапазоне 7,9÷8,2;

- проведение модификации клеток, суспендированных в растворе мономеров полиакриламидного геля, глутаровым альдегидом в оптимизированных условиях, обеспечивающих фиксацию клеточных белков в биокатализаторе, а также участие промежуточных продуктов взаимодействия глутарового альдегида с белками в процессе гелеобразования в качестве катализатора полимеризации мономеров.

Источники информации

1. Prubhune A.A., Rao B.S., Pandle A.V., SivaRaman H.: Immobilization of permeabilized Escherochia coli cells with penicillin acylase activity. Enzyme Microb Technol. 14: 161-163 (1992).

2. Pandle A., Prubhune A., SivaRaman H.: Immobilization of Saccharomyces uvarum cells in porous beads of polyacrylamide gel for ethanolic fermentation. Appi Microbiol Biotechnol 29:426-429 (1988).

3. US3957580 "Immobilized microbial cells"; SU608495 «Способ иммобилизации микробных клеток».

4. Sato Т., Tosa Т., Chibata I.: Continous production of 6-Aminopenicillanic acid from Penicillin by immobilized microbial cells. European J Appi Microbiol 2:153-160 (1976).

5. RU 1389296 «Способ получения биологически активных веществ, иммобилизованных в акрилатных гелях».

6. Sapan C.V., Lundblad R.L., Price С.: Review. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol Appi Biochem 29: 99-108 (1999).

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает культивирование клеток Escherichia coli, продуцирующих синтетазу цефалоспоринов-кислот. В качестве критериев выбора момента прекращения процесса биосинтеза фермента используют величину рН культуральной жидкости и константу распределения целевого фермента К_расп=А_бмк/А_р-р, где А_бмк - ферментативная активность биомассы клеток (МЕ/г влажн.), а А_р-р - ферментативная активность надосадочной жидкости (МЕ/мл). Процесс биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот прекращают при К_расп не менее 350 и значении рН 7,9÷8,2. Полученную биомассу клеток в концентрации 100÷150 мг сух./г полимеризационной смеси суспендируют в растворе акриламида и N,N'-метилен-бис-акриламида при весовом отношении 20:1. В течение 5÷30 мин осуществляют модификацию клеток глутаровым альдегидом, взятым в относительной концентрации 1·10^-3÷9·10^-3 ммоль/мг белка. Процесс полимеризации инициируют солью надсерной кислоты. Способ позволяет получить биокатализатор, обладающий высокими целевой активностью и стабильностью и не содержащий вымываемых при эксплуатации белков, загрязняющих целевой продукт биокаталитической трансформации. Синтетазная активность биокатализатора составляет 750-950 МЕ/г сух. 3 табл.

Способ получения биокатализатора на основе бактериальных клеток Escherichia coli, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот, включающий культивирование продуцента и иммобилизацию выращенной биомассы клеток, содержащих целевой внутриклеточный фермент, путем ее суспендирования в растворе мономеров полиакриламидного геля с последующим гелеобразованием под действием катализатора и инициатора полимеризации, отличающийся тем, что используют культуру Escherichia coli, продуцирующую фермент синтетазу цефалоспоринов-кислот, в качестве критериев выбора момента прекращения процесса биосинтеза фермента используют константу распределения целевого фермента К_расп=А_бмк/А_р-р,
где А_бмк - ферментативная активность биомассы клеток (МЕ/г влажн.);
А_р-р - ферментативная активность надосадочной жидкости (МЕ/мл);
и величину рН культуральной жидкости, прекращая процесс биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот при К_расп не менее 350 и значении рН 7,9÷8,2, биомассу клеток в концентрации 100÷150 мг сух./г полимеризационной смеси суспендируют в растворе акриламида и N,N'-метилен-бис-акриламида при весовом отношении 20:1, в течение 5÷30 мин проводят модификацию клеток глутаровым альдегидом, взятым в относительной концентрации 1·10^-3÷9·10^-3 ммоль/мг белка, в качестве инициатора процесса полимеризации используют соль надсерной кислоты.