СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2001 года по МПК C12P13/20 C12N1/20 C12P13/20 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения L-аспарагиновой кислоты, применяемой в медицине, пищевой и микробиологической промышленности.

Известны способы получения L-аспарагиновой кислоты путем биотрансформации фумарата аммония с помощью микроорганизмов рода Serratia (заявка EP 0111293, 1984), рода Escherichia (заявка EP 0110422, 1984), рода Pseudomonas, Bacillus, Brevibacterium и др. (заявка EP 0752476, 1997). Однако все эти способы являются многостадийными, достаточно трудоемкими, требуют специальных питательных сред для используемых штаммов.

Известен способ получения L-аспарагиновой кислоты с использованием штамма Escherichia coli 85 (авт. св-во СССР N 644833). Способ является недостаточно эффективным из-за невысокой аспартазной активности используемого штамма.

Наиболее близким к заявленному способу является способ получения L-аспарагиновой кислоты, предусматривающий обработку раствора фумарата аммония биокатализатором, на основе клеток Escherichia coli с последующим выделением L-аспарагиновой кислоты (авт. св-во СССР N 659611, C 12 P 13/20, 1979). В качестве биокатализатора в данном способе используют клетки одного из штаммов Escherichia coli 83 или АН 52, или 85, иммобилизованные включением в полиакриламидный гель. Процесс биотрансформации ведут, как правило, пропуская раствор фумарата аммония через колонку, заполненную частицами полиакриламидного геля с включенными в него клетками E. coli.

Недостатками способа являются невысокая эффективность процесса культивирования клеток Е. coli, получения биокатализатора и как следствие низкая эффективность всего процесса получения L- аспарагиновой кислоты.

Это связано с тем, что используемые в способе штаммы Е.coli требуют для своего выращивания многокомпонентных сред, стоимость которых достаточно высока. Кроме того, к недостаткам штаммов Escherichia coli можно отнести следующее: аспартазная активность штамма достигает максимальных значений на ранних логарифмических стадиях роста (6-10 ч), когда урожай клеток низкий. На стационарной фазе роста, когда достигается максимальный урожай клеток, аспартазная активность быстро снижается. В присутствии в питательной среде глюкозы, как источника углерода, аспартазная активность бактерий снижается и как результат этого снижается эффективность процесса получения аспарагиновой кислоты.

По этой причине при культивировании клеток E.coli приходится использовать большие объемы или осуществлять многократное воспроизведение клеток штамма-биотрансформатора.

Все вышеперечисленные факторы удорожают процесс и делают его неэффективным с точки зрения промышленного воспроизводства.

Настоящее изобретение направлено на повышение эффективности процесса получения L-аспарагиновой кислоты за счет снижения трудоемкости и удешевления процесса, связанного с применением более эффективного биокатализатора на основе нового штамма E.coli и особенностей культивирования штамма.

Технический результат заявленного способа заключается, в частности, в обеспечении более высокой аспартазной активности биокатализатора на основе клеток штамма Е.coli 858 (ВКПМ В-7188).

Таким образом, предлагаемый способ получения L-аспарагиновой кислоты путем биотрансформации фумарата аммония с помощью биокатализатора на основе микробных клеток Escherichia coli с последующим выделением целевого продукта предусматривает использование в процессе биотрансформации биокатализатора на основе штамма Е.coli ВКПМ В-7188, выращенного на питательной среде, содержащей уксусную кислоту.

В качестве биокатализатора в предлагаемом способе может быть использована биомасса клеток штамма Е.coli ВКПМ В-7188 как в нативном, так и в иммобилизованном виде. При этом может быть использована биомасса клеток штамма ВКПМ В-7188, выращенного на среде с содержанием уксусной кислоты 0,0001 до 5%.

Способ осуществляют следующим образом.

Характеристика используемого штамма E.coli 858 (ВКПМ В-7188).

Среди клонов Е.coli 85, образующих колонии на среде М9 с альфа-метил-D-глюкопиранозидом, 50 мМ (аналогом глюкозы) были выделены мутанты с высокой аспартазной активностью. Выделенные штаммы выращивали при 37^oC в колбах с перемешиванием. Среда для культивирования - М9 с добавлением: аммония хлорида 3 г/л, глюкозы 10 г/л, кукурузного экстракта 5 г/л. В табл. 1 представлены сравнительные данные по активности для родительского и выделенных мутантных штаммов.

Используемый в способе штамм Е.coli 858 (ВКПМ В-7188) показал повышение аспартазной активности при включении в питательную среду уксусной кислоты (или ее солей). Причем это повышение активности наблюдалось как для культур в логарифмической, так и в стационарной фазе.

Способ получения стационарных культур с высокой аспартазной активностью и урожаем клеток осуществляли культивированием клеток Escherichia coli на среде следующего состава, г/л:
Na₂HPO₄•12H₂O - 1.5
KH₂PO₄ - 0.75
NaCl - 0.5
CaCl₂ - 0.01
Фумарат натрия - 3
Ацетат аммония - 5
Кукурузный экстракт - 5
В этих условиях штамм Е.coli 858 обладает высокой аспартазной активностью, которая достигает максимума на стационарной фазе роста (21 ч). Результаты культивирования используемого и исходного штаммов в колбах представлены в табл. 2.

Таким образом, использование уксусной кислоты вместо глюкозы в качестве источника углерода для выращивания штамма Е. coli 858 позволяет решить две важные проблемы - повысить аспартазную активность клеток и обеспечить достижение максимального уровня активности на стационарной фазе, когда клеточный урожай достигает максимальных значений. Вводимое в питательную среду количество уксусной кислоты (от 0,0001 до 5%) является оптимальным. Повышение концентрации свыше 5% не приводит к повышению урожайности клеток.

Ниже приводятся примеры по получению клеток штамма Е.coli 858 (ВКПМ В-7188), являющегося биокатализатором процесса получения L-аспарагиновой кислоты, и примеры получения L-аспарагиновой кислоты с его использованием.

Аспартазную активность определяли следующим образом: к 4 мл 1М раствора фумарата аммония прибавляли 1 мл суспензии предварительно активированных микробных клеток и инкубировали смесь при перемешивании один час при 37^oC. Количество образовавшейся аспарагиновой кислоты определяли методом ВЭЖХ. За единицу активности принято образование одного микромоля аспарагиновой кислоты за один час. Оптическую плотность клеточной суспензии определяли при длине волны 540 нм и оптическом пути 5 мм.

Активирование микробных клеток перед получением L-аспарагиновой кислоты проводили инкубированием суспензии клеток в 1М растворе фумара аммония при 37^oC в течение 16-18 ч. Цель активирования - увеличение проницаемости клеточной мембраны для ионов фумарата и аспартата.

Пример 1. Культивирование микроорганизмов.

Односуточную культуру Escherichia coli 858 (ВКПМ-В-7188) смывают с поверхности МПА 1-2мл физиологического раствора и стерильно переносят в колбу Эрленмеера на 250 мл с жидкой питательной средой в объеме 50 мл следующего состава, г/л:
Na₂HPO₄•12H₂О - 1.5
KH₂PO₄ - 0.75
NaCl - 0.5
CaCl₂ - 0-01
Фумарат натрия - 3
Ацетат аммония - 5
Кукурузный экстракт - 5
pH 7.0. Культивирование ведут при 28-30^oC на круговом встряхивателе в течение 16-20 ч. Посевной материал переносят в трехлитровый ферментер, содержащий 2 л питательной среды того же состава. Условия культивирования: температура 29^oC, аэрация 2 л/мин, перемешивание 500 об/мин, pH 7.9. Система автоматического поддержания pH осуществляет дозировку питательного раствора уксусной кислоты (70 г). Время культивирования 22-26 ч. Оптическая плотность К.Ж. на сливе 20 ед. (540 нм). Удельная аспартазная активность 148.0 Ед.акт. /ОП. Общая аспартазная активность 2960 Ед.акт./мл. Клетки отделяли центрифугированием и промывали физиологическим раствором. Количество собранных влажных клеток в виде пасты составило 104 г.

Пример 2. Получение аспарагиновой кислоты свободными клетками.

0.8 г пасты клеток, полученной в примере 1, разводят в 19 мл 1М раствора фумарата аммония. Полученная суспензия имеет оптическую плотность 15 ед. (540 нм). Данную суспензию помещают в термостат на 37^oC на 17 ч.

В реактор с рубашкой и мешалкой объемом 250 мл помещают 180 мл раствора фумарата аммония. В рубашку реактора непрерывно подают воду с температурой 37^oC. При перемешивании добавляют суспензию активированных клеток. Реакцию трансформации ведут в течение 6 ч. Затем полученный раствор центрифугируют, отделяя микробные клетки, и к надосадочной жидкости при перемешивании добавляют 30%-ный раствор серной кислоты до достижения pH в растворе 2.9 ед. При этом выпадает обильный осадок аспарагиновой кислоты. Полученную суспензию охлаждают до 10^oC, выдерживают 1 ч. Осадок отделяют фильтрованием, промывают 200 мл захоложенной воды и сушат при температуре 50^oC до постоянного веса. Количество полученного продукта 21.4 г.

Пример 3. Получение L-аспарагиновой кислоты с помощью иммобилизованных в полиакриламидном геле клеток Е.coli 858.

Биомассу клеток штамма Е.coli 858 из примера 1 в количестве 15 г суспензируют в 27.3 г раствора аспарагината натрия с концентрацией 20%, pH 7.5 Смесь охлаждают до 5^oC и к охлажденной смеси добавляют последовательно 6.15 г акриламида, 0,36 г N,N'-метилен-бис-акриламида, 1,0 г 5%-ного водного раствора N,N,N',N'- тетраметилэтилендиамина и 0,2 свежеприготовленного 5%-ного водного раствора персульфата аммония.

Полученный гель измельчают, промывают сначала водой, потом 1,5 М раствором фумарата аммония. Гранулами геля заполняют термостатируемую при 30^oC колонку и пропускают через нее 1,5 М раствор фумарата аммония, содержащий 0,0001 MgSO₄, pH 8,5. Выделение L-аспарагиновой кислоты проводят как в примере 2. Из 1000 мл элюата получают 184 г кристаллической L-аспарагиновой кислоты. Удельный угол вращения в 5 н. HCl[α]20D

Изобретение относится к способу получения L-аспарагиновой кислоты, применяемой в пищевой, микробиологической промышленности и медицине. Способ заключается в биотрансформации фумарата аммония с помощью биокатализатора, полученного на основе клеток штамма Escherichia coli 858 (ВКПМ В-7188), и выделении целевого продукта. При выращивании штамма E. coli 858 на питательной среде, содержащей уксусную кислоту, достигается высокая аспартазная активность. Клетки штамма Е. coli 858 используют в нативном или иммобилизованном виде. Предлагаемый способ получения L-аспарагиновой кислоты является более экономичным за счет удешевления и интенсификации получения клеток штамма Е. coli 858 по сравнению с известными способами. Эффективность получения целевого продукта обусловлена также применением более активного биокатализатора на основе штамма Е. coli 858. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения L-аспарагиновой кислоты путем биотрансформации фумарата аммония с помощью биокатализатора на основе клеток Escherichia coli с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что в процессе трансформации используют биокатализатор на основе штамма Escherichia coli ВКПМ В-7188, выращенного на питательной среде, содержащей уксусную кислоту. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют биомассу клеток штамма E.coli ВКПМ В-7188 в нативном или иммобилизованном виде. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют биомассу клеток штамма E. coli ВКПМ В-7188, выращенную на среде, содержащей 0,0001-5% уксусной кислоты.