Кюветная камера для определения аденазинтрифосфата Советский патент 1980 года по МПК A01G7/00 G01G1/30 

Изобретение относится к технике измерения слабых свечений при биопюминес- центных реакциях, а именно к устройствам кюветных камер для биолюминесцентного измерения количества аденазинтрифосфата (АТФ) по его реакции с люциферин-люциферазным фермент-субстратным комплексом из светоносных органов светляков OcioGa mingraeicoi. Известна кюветная камера для определения АТФ, содержащая установленный на опоре светонепроницаемый корпус, в котором находится фотодетектор с рабочим окном и кювета для введения реагентов. Фотодетектор отделен от кюветы с помощью фотозатвора i, Однако в таком устройстве при заполнении кюветы фермент субстратным комплексом пюпиферин-люциферазы вне светонепроницаемой камеры возникает значвтел ная нестабильная ошибка за счет паразитной затухающей люминесценции стекла кю.веты, возбуждаемой при проведении манипуляций с кюветой на свету. Кроме тсяо. наличие фотозатвора обуславливает необходимость применения блокировочных устройств для защиты фотодетектора, в результате чего усложняется эксплуатация кюветной камеры. Например, при проведении одного измерения необходимо минимум два раза вынуть кювету из камеры и выполнить шесть операций по открытию и закрытию фотозатвора. Удаленность кюветы от фотодетектора ведет к потерям за рассеяния света, Известна также конструкция кюветной камеры для биолюминесцентного определения .аденааинтрифосфата, содержащая установленный на опоре светонепроншаемый корпус, в котором размешен фотодетектор с рабочим окном и кювета с сифоном для введения в нее реагентов, причем кювета отделена от фотодетектора с помощью фотозатвора {2 , Такая конструкция кюветной камеры имеет те же недостатки, кроме того, используемый способ перемешивания реагентов не всегда обеспечивает реакцию достаточным количеством кислорода, поскол ку перемешивание реагентов в кювете ocj ществляется за счет впрыскивания через сифон исследуемого раствора ДТФ в определенный оЪьем фермент-субстратного комплекса, что отражается на результатах измерения, так как реакция лимитируется по кислороду. Цель изобретения - улучшение эксплуатационных характеристик кюветной камерЫ} повышение точности измерения и устранение паразитной люминесценции. Это достигается тем, что кювета установлена непосредственно на рабочем окне фотодетектора и между кюветой и фотодетектором размешен слой опт11ческой смазки, причем кювета снабжена дополнительным сифоном и связанной.с ним системой вакуумного отсоса и продувки реагентов газами, а свето 5епроницаемый корпус кюветной камеры установлен на опоре шарнирно. На фиг, 1 схематически изображена предлагаемая кюветная камера, продольный разрез; на фиг;- 2 - сечение А-А. на фиг,, 1 (сечение по шарнирному соединению корпу са кюветной камеры с опорой). Предлагаемая кюветная камера соде|р- жит светонепроницаемый корпус 1, в кото рый заключена кювета 2 для реагентов с зеркальным отражающим покрытием ее боковой внешней поверхности, установленная непосредственно на рабочем окне 3 фотодетектора (фотоумножителя) 4. Оптическая Связь кюветы 2 и фотодетектора 4 осуществляется через слой оптической смазки 5 (например, селиконового масла). Механическое крепление кюветы 2 к фотодетектору 4 обеспечивается оправой 6, например, из пластмассы. Для введения реагентов и промывочных растворов в -KJO вету 2 служит сифон 7, а для отсоса отработанных реагентов и промывочных раст воров кювета 2 снабжена дополнительным сифоном 8, который сообщен через трехходовой кран 9, магистраль 10 и перепускную емкость 11 с вакуумом, наприме водоструйным насосом (на черт, не показан). Для перемешивания реагентов и обо гащения их кислородом (газами), осущест вляемого путем продувки кислорода (газов) через сифон 8, последний также через ходовой кран 9 соединен с магистралью 12, обеспечивающей подачу кислорода (газов) в сифон В. Кюветная камера имеет вертикальное рабочее положение и закреплена на штативе с помощью шарнира 13 С фиксатором (на черт, не показан) для отклонения кюветной камеры от рабочего положения. Это значительно облегчает и ускоряет отсос отработанных реагентов и промывочных растворов из кюветы. Измерения в предлагаемой кюветкой камере осуществляют следующим образом. После проведения темнового тока фотодетектора 4 в кювету 2 через входной сифон 7 впрыскивают с помощью шприцадозатора (на черт, не показан) определенный объем фермент-субстратного комплекса люпиферин-люциферазы и измеряют уровень свечения (фоновое высвечивание). Затем в кювету 2 через сифон 7 вводят также с помошью шприца-дозатора исследуемый раствор с АТФ. Одновременно включают блок регистрации свечения с отметч шом времени и подачу кислорода (газов) через дополнительный сифон 8 для обогащения кислородом (газами) и перемешивания реагентов. Через 1О сек подачу кислорода (газов) отключают перекрытием трехходового крапа 9, после чего реакция свечения стабилизируется в течение 20 сек. Затем проводят регистрацию свечения в течение 60 сек. Снятие показаний осуществляется автоматически через равные интервалы времени (например, через 1О сек) на цифропечать. По окончании измерений с помошью трехходового крана 9 подключают отсос воздуха для создания в перепускной емкости 11 вакуума и отработанные реагенты поступают в перепускную емкость 11. Затем через сифон 7 вводят промывочный раствор и одновременно отсасывают его в перепускную емкость 11. Полный отсос промывочного раствора из кюветы 2 производят наклоном кюветной камеры на 25-ЗО С от вертикального (рабочего) положения вокруг шарнира 13. Степень промывки кюветы 2 контролируют по величине темнового тока фотодетектора 4. По окончании проМывки отсос воздуха отключают, а кюветную камеру возвращают в исходное положение. После этого она готова к новому циклу измерений. Длительность обработки одной пробы .составляет5-6 мин. Испытания кюветной камеры показали, что при использовании неочищенного комплекса люциферин-людиферазы можно уверенно определить до 1О г АТФ в 1 мл пробы, тогда как в кюветной камере по прототипу определяется до 10 АТФ. Затраты времени на одно определение снижаются более чем в два раза.

Предлагаемая кюветная камера может найти широкое применение в научно-исследовательских учреждениях при проведении массовых исследований с различными целями.

Формула изобретения

Кюветная камера для определения аденазинтрифосфата, содержащая установленный на опоре светонепроницаемый корпус, в котором размещен фотодетектор с рабочим окном и кювета с сифоном для введе- ния в нее реагентов, отличагощая с я тем, что, с целью улучшения эксплуатационньк характеристик кюветной камеры, кювета установлена непосредственно на рабочем окне фотодетектора н между кюветой и фотодетектором размешен слой оптической смазки, причем кювета снабжена дополнительным сифоном и связанной с ним системой вакуумного отсоса и продувки реагентов газами, а светонепроницаемый корпус кюветной камеры установлен на опоре шарнирно. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Патент США № 3359973, кл. 128-1, 1967.

2.Данюков Ю. Г. и Мильман Л. С.

Упрощенный фотоэлектрический прибор для энзиматического определения АТФ при помощи систем ы Люцифер ин-люцифера за, Вопросы медицинской химии, т. 12, в. 5, с. 548-555 1966 (прототип).

Подача taJof