Способ количественного определения адениновых нуклеотидов Советский патент 1987 года по МПК C12Q1/66 

113

Изобретение относится к биохимическому анализу, а именно к способу определения адениновых нуклеотидов: аденозин-5 -монофосфата (АМФ), адено зин-З -дифосфата (АДФ) и аденозин- -5 -трифосфата (АТФ).

Цель изобретения снижение предела обнаружения, а также сокращение расхода ферментов при определении адениновых нуклеотидов.

Способ заключается в следующем.

В качестве источника людиферазы и аденилаткиназы используют содержащий оба фермента экстракт лампочек светляков Luciola mingrelica, который получают экстракцией 0,1 М фосфатным буфером, содержащим 0,2 М NaCl и 2 мМ ЭДТА, рН 8,0 в течение 12 ч при 4°С при весовом соотношении лампочки светляков - буфер от 1:40 до 1:10, Экстракт лампочек светляков и грубоочищенный препарат пируваткина- зы из мышц кролика соиммобилизуют на бромцианактивированной сефарозе. При иммобилизации используют 50 мг/м.п лампочек светляков, концентрацию пи- руваткиназы варьируют от 3 до 12 мг/ /мл и носителя от 50 до 100 мг/м.л. При концентрациях пируваткиназы ниже 3 мг/мл получаются препараты с низкой пируваткиназной активностью, что уменьшает скорость превращения АМФ и АДФ в АТФ и приводит к увеличению расхода реагентов и времени анализа. При концентрациях пируваткиназы выше 12 мг/мл препараты имеют низкую люциферазную активность, что уменьшает чув.ствительность определения нуклеотидов. При использовании концентрации бромцианактивированной сефарозы при иммобилизации ниже 50 мг/мл происходит потеря дорогостоящих ферментов, вследствие их неполного связывания с носителем , а при использовании выше 100 мг/мл сефарозы получаются препараты с низкими люциферазной, аденилаткиназной и пируваткиназной активностями, которые не дают высокой чувствительности при анализе.

Повьш1ение чувствительности определения АТФ и АДФ с помощью соиммоби- ли,зованиой полиферментной системы по сравнению с растворимой, по-видимому обусловлено увеличением локальной концентрации ферментов и продуктов вблизи поверхности носителя. Это увеличивает стационарные скорости фер0272

ментативных реакций в иммобилизованной полиферментной системе и облегчает диффузионный перенос субстратов и продуктов одной ферментативной ре5 акции к активному центру другой. В соиммобилизованной полиферментной системе уменьшается влияние побочных факторов за счет пространственного разделения ферментов на носителе,

О уменьшается ингибирующее влияние пируваткиназы на люциферазную реакцию, что наблюдается при работе с растворимыми ферментами. Кроме того, вследствие .локального концентрирова 5 ния вблизи носителя образовавшаяся АТФ подвергается меньшему гидролизу, чем было бы в растворе. Все эти факторы обеспечивают гораздо большую эффективность соиммобилизованной по20 лиферментной системы по сравнению с растворимой,,

Анализ адениновых нуклеотидов с помощью препарата соиммобилизованных люциферазы, аденилаткиназы и пируваткиназы проводится следующим образом по схеме:

АМФ+цТф (1)

in А гт i пируваткиназа - АДФ+фосфоенолпируват

25

АТФ+пируват

(2)

35

АТФ+люциферин +0

люцифераза

АМФ+

+оксилюциферин+неорганич.фосфат+ +С02+ li)

.(3)

АТФ определяют с этим препаратом

известным методом по реакции (1), Со- иммобилизованные с люциферазной аде- нилаткиназа и пируваткиназа не влияют на чувствительность определения. Интенсивность излучения прямо пропорциональна концентрации АТФ,

Для определения АДФ его сначала превра цают в АТФ по реакции (2) при инкубировании с препаратом соиммобилизованных ферментов и фосфоенолпируватом в течение 1 мин. Полученную АТФ определяют аналогично. Для этого. после добавления к смеси люциферин- содержащего буфера регистрируют излучение, интенсивность которого пропорциональна концентрации АДФ в системе, Неизвестную концентрацию АДФ определяют из калибровочной прямой.

Для определения АМФ его превращают в АТФ по реакциям (1 и 2) инкуби313

рованием сначала в течение 30 мин с полиферментным препаратом и цитидин- -5 -трифосфатом (ЦТФ), а затем 1 мин с фосфоенолпируватом. Получающийся АТФ определяют как было указано. После добавления люциферинсодержащего буфера регистрируют сигнал, который пропорционален содержанию АМФ в системе. Неизвестную концентрацию АМФ определяют из калибровочной прямой,

С помощью предлагаемого препарата соиммобилизованных ферментов можно определять как общее содержание аде- ниновых нуклеотидов в образце, так и содержание каждого из них в отдельности, причем для определения АМФ и АДФ необходимо предварительное отделение АТФ от других адениновых нуклеотидов, поскольку содержание АТФ в биологических образцах, как правило, в несколько раз выше, чем АМФ и АДФ. Отделение АТФ производят с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ- целлюло 3 е.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Получение препарата соиммобилизованных ферментов,

50 мг лампочек светляков экстрагируют 1 мл 0,1 М Na-фосфатного буфера; 0,2 М NaCl; 2 мМ ЭДТА; рН8,0 при 4°С в течение 12ч. 1 мл экстракта инкубируют с 50 мг набухщей бромциансефарозы и 7 мг пируваткина- зы в течение 24 ч при А С. Осадок промывают по 5 раз попеременно 5 мл 0,02 М Na-ацетатного буфера (1 М, NaCl, рН 4,0) и 5 мл трис. -ацетатного буфера (1 М NaCl, рН 8,5), а затем 5 раз по 10 мл дистиллированной водой и 5 раз по 5 мл 0,1 М ту ис-ацетатного буфера, рН 7,6, 2 мМ ЭДТА. Концентрация полученной суспензии иммобилизованных ферментов 10 мг/мл, активность люциферазы в препарате - 42000 мв/мг носителя и активность пируваткиназы - 12 Е/мг носителя. Определение АТФ,

1 мл раствора, находящийся в пласт массовой кювет(, содержащий 1 мг/мл суспензии соиммобилизованных ферментов, 1 мМ люциферин, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgS04 в 0,1 Мтрис -ацетатном буфере рН 7,8 помещают в люминометр и измеряют фоновое свечение, которое для данного препарата не превышает 0,1 мв Затем к этому раствору добавляют 50 мкл раствора АТФ известной кон0274

центрации, не прерывая регистрации свечения. Разность между интенсивностью сигнала в присутствии АТФ и фоновым сигналом пропорциональна концентрации АТФ. Опыты повторяют для растворов АТФ с концентрациями АТФ в том же диапазоне, в котором предполагается вести измерения. На основе полученных данных строят график за0 висимости интенсивности биолюминесценции от концентрации АТФ. Для полученного препарата соиммобилизованных ферментов прямо пропорциональная зависимость наблюдается в диапазоне

5 концентраций АТФ 10 пМ-0,10 мМ, Концентрацию АТФ в неизвестном образце определяют по полученному калибро- вочному графику. Предел обнаружения АТФ с помощью этого реагента состав0 ляет 10 пМ,

Определение АДФ, К 0,7 мл 0,1 М трис-ацетатного буфера рН 7,8, находящегося в плас- 5 тиковой кювете для люминометра и содержащего 2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgS04, 20 мМ ацетата калия и 5 мМ фосфоенол- пирувата, добавляют 50 мкл раствора АДФ известной.концентрации и 0,1 мл ,, суспензии соиммобилизованных ферментов (10 мг/мл) в том же буфере. После инкубирования смеси в течение 1 мин при комнатной температуре кювету помещают в люминометр, добав- . ляют Oj3 мл люциферина до получения в кювете концентрации 1 мМ и регистрируют сигнал, который прямо пропорционален концентрации АДФ в системе, Опыты повторяют для растворов АДФ с .- концентрациями в том же диапазоне, в котором предполагается вести измерения. На основе полученных данных строят калибровочный график зависимости интенсивности биолюминесценции 1г от концентрации АДФ, с помощью которого определяют концентрацию АДФ в неизвестном образце. Для полученного .препарата соиммобилизованных ферментов прямо пропорциональная зависй- Q мость наблюдается в диапазоне концентрации АДФ 10 пМ - 0,10 1. Предел обнаружения АДФ для этого ферментного препарата составляет 10 мМ.

Определение АМФ,

5 К 0,6 мл 0,1 М трис -ацетатного буфера рН 7,8, находящегося в кювете, и содержащего 2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgSO, 20 мМ ацетата калия и 1 мМ ЦТФ, добавляют 50 мкл раствора АМФ известной

концентраций и О, мл суспензии со- иммобилизованных ферментов (10 мг/мл) в том же буфере. Смесь инкубируют в течение 30 мин, перемешивая, после чего добавляют 50 мкл 0,1 М фосфоенол-5 пирувата. Кювету помещают в люминофор и через 1 мин вводят 0,2 мл люцифери- на (концентрация его в кювете 1 мМ) и регистрируют излучение. Поскольку интенсивность биолюминесценции про- 0 порциональна концентрации АМФ в системе, то используя известные концентрации АМФ в том диапазоне, в котором предполагается вести измерения, строят калибровочный график. Неизвестную 15 концентрацию АМФ находят по сигналу биолюминесценции, используя калибровочную прямую. Для данного препарата соиммобилизованных ферментов прямо пропорциональная зависимость по АМФ 20 наблюдается в диапазоне концентраций Г нМ - 0,10 мМ. Предел обнаружения АМФ для данного ферментного препарата составляет 1 нМ.

Пример 2. Получение препара- - та соиммобилизованных ферментов.

Препарат получают также, как в примере 1, но при иммобилизации используют 3 мг пируваткиназы при тек же концентрациях всех остальных ве- 0 ществ. Полученный препарат обладает лю1щферазной активностью 55000 мв/мг носителя и пируваткиназной активностью 8 Е/мг носителя.

.Определение АТФ с полученным фар- 35 ментным препаратом проводят также, , как в примере 1. Диапазон определяе- мьсх концентраций АТФ и предел обнаружения АТФ такие же, как в примере 1.

Определение АДФ проводят также, как в примере 1. Чувствительность . анализа не зависит от концентрации используемой при определении суспензии. / лапазон определяемых с данным препаратом соиммобилизованных фермен- тов концентраций АТФ составляет 50 пМ - 0,1 мМ. Предел обнаружения50 пМ,

Определение АМФ проводят также, Q

ак в примере 1. Диапазон определяеых концентраций АМФ 1,0 нМ - 0,1 мМ. редел обнаружения АМФ - 1,0 нМ.

Пример 3. Получение препаата соиммобилизованных ферментов.

Препарат получают также, как в римере 1, но при иммобилизации исользуют 12 мг пируваткиназы при сех прочих рдвных концентрациях и

УСЛОВИЯХ, Полученньш препарат имеет активность люциферазы 35000 мв/мг носителя и активность пируваткиназы- 25 Е/мг носителя.

Определение АТФ с полученным полиферментным препаратом проводят также, как в примере 1. Сигнал биолюминесценции пропорционален концентрации АТФ в диапазоне 50 пМ - 0,1 мМ. Предел обнаружения АТФ - 50 пМ.

Определение АДФ проводят также, как в примере 1. Диапазон определяемых с данным полиферментным препаратом концентраций АДФ - 50 пМ -0,1 мМ. Предел обнарутг ения АДФ 50 пМ.

Определение АМФ проводят также, как в примере 1. Диапазон определяемых с данным ферментным препаратом концентраций АМФ составляет 5 нМ - .0,1 мМ. Предел обнаружения АМФ 5 нМ

Пример 4. Получение препарата соиммобилизованных ферментов.

Препарат получают также, как в примере 1, но при иммобилизации используют 100 мг бромцианактивирован- ной сефарозы. В полученном препарате активность люциферазы составляет 25000 мв/мг носителя и активность пируваткиназы 9 Е/мг носителя.

Определение АТФ с полученным полиферментным препаратом проводят также, как в примере 1. Сигнал биолюминесценции пропорционален концентрации АТФ в диапазоне, 0,1 нМ-0,1 мМ. Предел обнаружения АТФ -0,1 нМ.

Определение АДФ проводят также, как в примере 1, Диапазон определяемых с данным препаратом концентраций АДФ составляет 0,1 нМ - 0,1 мМ, Предел обнаружения АДФ - 0,1 нМ.

Определение .АМФ проводят также, как в примере 1. Диапазон определяемых с данным полиферментным препаратом концентраций АМФ составляет 5 нМ- 0,1 мМ, Предел обнаружения АМФ - 5 нМ.

С помощью полученных препаратов соиммобилизованных на бромцианакти- вированной сефарозе люциферазы, пи- руваткиназы и аденилаткиназы возможно определять как сумму всех адени- новых нуклеотидов в образце, так и содержание каждого из них в отдельности (последнее реально при условии отделения АТФ от АМФ и АДФ),

Наилучшими полиферментными препаратами, позволяющими определять все

71

адениновые нуклеотиды с высокой чувствительностью вплоть до концентраций 10 пМ являются препараты, в которых при иммобилизации на 50 мг/мл лампочек светляков использовались пируваткиназа в диапазоне концентраций, от 3 до 12 мг/мл и носитель - бромцианактивированная сефароза в диапазоне концентраций 50-100 мг/мл. Препараты, полученные с меньшей и с большей концентрацией пируваткиназы и носителя, чем указанные в диапазоне, обладают меньшей чувствительностью, и их можно использовать для определения адениновых нуклеотидов с концентрациями не ниже 1 нМ.

Изобретение обеспечивает повышени чувствительности способа определения АТФ и АДФ в сотни раз по сравнению с известными методами. С использованием полученного препарата сойм- мобилизованных ферментов способ оп- ределеиня становится проще. За счет сокращения числа операций, увеличивается экономичность процесса; уменьшается его стоимость за счет использования неочищенных ферментов, возможности многократного использования одного препарата и увеличения стабильности ферментов после их иммобилизации. Полученньй препарат может быть использован в научных целях для изучения метаболизма адениновых нукРедактор И.Сегляник Заказ 2394/23

Составитель Л.Борисова

Техред М.Ходанич Корректор Л.Патай

Тираж 499 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производствеино-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

7027 .8

леотидов различных биологических объектов, а также для определения активности АТФ, АДФ и АМФ - зависимых ферментов. Он может также использоваться в целях медицинской диагностики, в пищевой промышленности и микробиологической промьгашенности для контроля за уровнем адениновых нуклеотидов.

Формула изобретения

Способ количественного определения адениновмх нуклеотидов, предусматривающий проведение ферментных реакций с использованием люциферазы, аденилаткиназы лампочек светляков Luciola mingrelica и пируваткиназы с последующей регистрацией продуктов биолюминесцентным методом, о т л.и- чающийся тем, что, с целью снижения предела обнаружения адениновых нуклеотидов и сокращения расхода ферментов, для проведения ферментативных реакций используют неочищенные люциферазу и аденилаткиназу лампочек светляков и грубоочищенную пи- руваткиназу из мьшц кролика, подвергнутые соиммобилизации на бром- циансефарозе при массовом соотношении лампочки светляков : пируваткиназа : бромциансефароза 50:(3-12): :(50-100).

Изобретение относится к области биохимического анализа. Целью изобретения является снижение предела обнаружения адениновых нуклеотидов и сокращение расхода ферментов. Способ осуществляется с помощью соиммобили- зованной системы люциферазы,аденилат- киназы и пируваткиназы. В качестве источника люциферазы и аденилаткина- зы используют неочищенные лампочки светляков Luciola mingrelica. Массовое соотношение лампочек светляков : : пируваткиназа : бромциансефароза составляет 50:(3-12):(50-100). Способ позволяет снизить расход дорогостоящих высокоочии енных ферментов и повысить чувствительность определения. Способ может найти применение в медицине, пищевой промьшленности и в научных исследованиях. (Л