МЕЧЕННОЕ ЛЮЦИФЕРАЗОЙ АНТИТЕЛО И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ АНАЛИЗА НА СПЕЦИФИЧЕСКОЕ СВЯЗЫВАНИЕ И НАБОР ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В АНАЛИЗЕ НА СПЕЦИФИЧЕСКОЕ СВЯЗЫВАНИЕ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/535 G01N33/58 C12Q1/68 

Изобретение относится к способу мечения химических материалов, в частности биологических материалов, для проведения химических анализов, конкретно биологических анализов, а более конкретно анализов на специфическое связывание, таких как иммуноанализ и анализ методом гибридизационного зондирования, а также для включения меток в продукты специфической амплификации, например, при использовании полимеразной цепной реакции (PCR) в анализах определенного типа.

Реакция расщепления люциферина (см. ниже уравнение 1), опосредованная люциферазой, происходящей от светлячка, имеет высокий количественный выход и стабильное свечение, что позволяет обнаруживать сам фермент даже при очень низких концентрациях с использованием относительно простой аппаратуры (см. McCapra. Potential application of bioluminescence and chemiluminescence in Turner et al. (Edit.) Biosensors fundamentals and applications: Oxford University Press, (1988): 617-37). Было разработано много методов с использованием люциферазы в качестве непрямой метки (см. Wannlund and DeLuca, "Bioluminescence immunoassays: Use of luciferase antigen conjugates for determination of methoxylate and DNP" в Deluca & McElroy (Edits). Bioluminescence and Chemiluminescence: Basic chemistry and analytical applications. London: Academic Press, (1981): 693-696; Geiger & Miska, Bioluminescence anhanced anzyme immunoassay: New ultrasensitive detection system for enzyme immunoassay, Clin. Chem. Clin. Biochem. J. (1987) 25, 31-38; и Murakami et al., Development of a bioluminescent detection system using adenylate kinase and firefly luciferase" в Szaly et al., (Edits) Bioluminescence and chemiluminescence: Status Report, Chichester: John Wiley & Sons, (1993) 296-300).

Авторами настоящего изобретения было замечено, что схему анализа можно значительно упростить, сохраняя при этом чувствительность анализа, посредством использования люциферазы в качестве прямой метки, но при этом необходимо, чтобы такое связывание люциферазы с аналитическими связующими агентами не приводили к инактивации ее ферментативной активности, которая, как известно, является весьма неустойчивой. Стандартные ковалентно связующие реагенты, такие как глутаральдегид, SMCC и SMPB быстро и необратимо ингибируют люциферазную активность.

Люцифераза, происходящая, например, от Photinus pyralis (американский светлячок), содержит четыре цистеиновых остатка (см., Wet et al. (1987) Molecular and Cellular Biology, 7, 725-737), два из которых находятся возле активного центра или являются его частью (см., Deluca & McElroy (1978), Methods in Enzymology, 57, 3-15). Авторами настоящего изобретения было установлено, что связывание ковалентно связующихся реагентов с этими остатками может вызывать наблюдаемую инактивацию фермента, а поэтому был разработан способ связывания люциферазы с такими аналитическими агентами, которые защищают фермент от необратимого ингибирования.

Таким образом, в своем первом аспекте настоящее изобретение относится к способу конъюгирования люциферазы светлячка с химической молекулой, а в частности, со специфически связывающим агентом, таким как антитело, антиген, или нуклеиновая кислота, а еще более конкретно с антителом; причем указанный способ предусматривает (а) смешивание люциферазы с одним или несколькими компонентами, а именно с D-люциферином, ионами магния, и аденозинтрифосфатом, так, чтобы концентрации ионов магния и аденозинтрифосфата составляли более чем 0,2 ммоль/л и 0,05 ммоль/л соответственно; и (b) осуществление реакции ковалентного связывания люциферазы и химической молекулы с использованием ковалентно связывающегося реагента.

Стадию (а) осуществляют предпочтительно путем смешивания люциферазы с ее субстратами в растворе; при этом предпочтительно, чтобы магний и аденозинтрифосфат присутствовали в виде комплекса АТР с магнием (Мg²⁺АТР) необязательно вместе с D-люциферином. Предпочтительно, чтобы в реакции присутствовал либо Мg²⁺АТР, либо D-люциферин. Если Мg²⁺, АТР и люциферин присутствуют вместе, то предпочтительно исключить из реакционной смеси кислород.

Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к меченой химической молекуле, представляющей собой химическую молекулу, конъюгированную с активной люциферазой светлячка в соответствии со способом настоящего изобретения. Предпочтительной химической молекулой является специфически связывающийся агент, подходящий для использования в анализе на специфическое связывание, предпочтительно антитело, антиген или нуклеиновая кислота. Если связующим агентом является нуклеиновая кислота, то предпочтительно, чтобы это был олигонуклеотид, но может быть также использован полинуклеотид или нуклеозид, либо праймер, используемый в качестве гибридизационного зонда, или праймер для удлинения цепи, например PCR-праймер. Наиболее предпочтительной молекулой является антитело, поскольку предпринимаемые ранее попытки связывания антител с люциферазой приводили почти к полной ее инактивации.

Главным преимуществом получения меченных люциферазой химических молекул, в частности меченных люциферазой антител, является возможность осуществления анализа с захватом антител на световоде. В одном из предпочтительных вариантов такого анализа антитело для антигена-мишени иммобилизуют на световоде, например оптическом волокне, установленным таким образом, что падающий на него световой сигнал передается после его прохождения через световод на фотоэлектронное измерительное устройство, например фотоумножитель; определяемый антиген в жидком образце наносят на указанный световод; и "второе" антитело, помеченное люциферазой, подвергают в растворе контакту со световодом, в результате чего это меченое антитело связывается с уже захваченным антигеном, который был связан с иммобилизованным антителом.

Для определения присутствия и/или количества захваченного антигена необходимо только D-люциферин и Мg²⁺-АТР в растворе подвергнуть контакту с поверхностью световода, на которой присутствует связанный с ней комплекс антиген-антитело, а затем измерить количество испускаемого света, передаваемого на фотоэлектронное измерительное устройство, такое как фотоумножитель. В этом способе люминометрический анализ может быть проведен с большей чувствительностью и с множественной специфичностью, если использовать несколько световодов, каждый из которых способен "захватывать" разные антигены и если каждый из этих световодов поместить в отдельную камеру для образца так, чтобы можно было одновременно проводить несколько различных иммуноанализов путем добавления в одной и той же стадии несколько различных антител, меченных люциферазой.

Альтернативно прибор с зарядовой связью (ПЗС) или эквивалентные устройства, такие как диодная матрица или фотоумножитель, могут быть использованы для одновременного мониторинга ряда дискретных областей на поверхности 1 или 2 пространственных детекторных матриц, на каждой из которых иммобилизованы разные антитела, специфичные к различным антигенам, так, что присутствие конкретного антигена может быть обнаружено по локализации светового излучения. Аналогично использование таких световодов или приборов с зарядовой связью, на которых иммобилизованы антигены или антитела против иммуноглобулинов, специфичные к антителу-мишени, позволяет осуществлять анализ на специфические антитела путем конкурентного связывания, где количество меченного люциферазой антитела, связанного с антигеном на световоде, будет уменьшаться при одновременном добавлении конкурирующего антитела в виде образца.

После удаления образца и меченного люциферазой антитела и после обработки световода раствором D-люциферина и Мg²⁺-АТР-субстрата количество света, детектируемого фотоумножителем, может быть соотнесено с количеством антитела в образце, которое является специфичным к иммобилизованному антигену или к антителу против иммуноглобулинов.

При этом следует отметить, что если использовать световоды, на поверхности которых присутствуют связанные с ней олигонуклеотидные зонды (см. метод, описанный в заявке WO 9306241, авторов настоящего изобретения) и олигонуклеотиды, меченные люциферазой, то может быть осуществлен анализ олигонуклеотидов и полинуклеотидов аналогично анализу с использованием комплекса антиген-антитело, как описано выше. Кроме того, с помощью различных световодов или областей диодной матрицы можно проводить одновременный анализ антигенов и нуклеиновых кислот из одного и того же образца.

Главное преимущество осуществления анализа с использованием меченного люциферазой материала, связывающегося на поверхности световода, такого как плоский волновод или оптическое волокно (их может быть несколько), заключается в том, что в этом анализе отделение реагентов от нужного образца, т. е., связанного образца, не имеет решающего значения, поскольку детектор регистрирует преимущественно тот свет, который генерируется на нескольких сотнях нанометров поверхности световода, а не тот свет, который генерируется в основном объеме раствора. Таким образом, анализ такого типа (обычно называемого анализом типа "резкого снижения") не требует проведения стадий промывки или последовательного добавления реагентов, а поэтому он может быть осуществлен очень быстро и необязательно в потоке жидкости с использованием проточной кюветы.

Меченые агенты настоящего изобретения, а также способ их получения и использования наглядно проиллюстрированы в нижеследующих примерах со ссылками на чертежи, однако при этом следует отметить, что эти примеры не должны рассматриваться как ограничение изобретения.

На фиг.1 представлен график зависимости люминесценции от времени, полученный после инкубирования люциферазы с ковалентно связующим агентом при защите фермента различными количествами Мg²⁺АТР, как описано в примере 1.

На фиг. 2 представлены графики зависимости люминесценции от количества рицина, полученные по результатам анализа, проведенного, как описано в примере 1. Верхний график получен с использованием 1/100-разведения конъюгата lgG-люциферазы, а нижний график получен с использованием 1/1000-разведения конъюгата.

Уравнение 1:
Реакция с участием люциферазы светлячка:

LH₂ - АМФ.Е + О₂ --> L + СО₂ + АМФ + свет,
где LH₂ - люциферин; Е - люцифераза; АМФ - аденозинмонофосфат, ФФ₁ - неорганический пирофосфат; а L - оксилюциферин.

Пример 1
Для всех измерений светового излучения были использованы люминометр Multilite^® и полистироловые 3,5-миллилитровые пробирки (Biotrace Bridgent UK). Люцифераза светлячка (L-5256), DTT, BSA (Фракцию V), АТФ и рицин были получены от Sigma (Рооlе, UK); D-люциферин был получен от Fluka (Gillingham, UK), а сульфосукцинамидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) был получен от Pierce & Warriner (Chester, UK). Овечьи антитела против рицина продуцировали стандартными методами. Другие используемые реагенты имели аналитическую чистоту.

В качестве субстрата для люциферазы использовали 10 ммоль/л буфера HEPES (рН 7,75), содержащего 0,4 ммоль/л D-люциферина, 40 ммоль/л сульфата магния, 2 ммоль/л АТФ (аденозинтрифосфат), 2 ммоль/л ЭДТК, 2 ммоль/л DTT (дитиотрейтол), 0,2% BSA (альбумин бычьей сыворотки) и 2 гмоль/л пирофосфата натрия. Свежий субстрат приготавливали ежедневно из маточных растворов. Анализ на активность люциферазы проводили путем добавления 2•10^-6 л анализируемого образца к 200•10^-6 л субстрата (описанного выше) в полистироловой 3,5 мл/пробирке и последующего измерения люминесценции после 5-секундной задержки с интегрированием данных за период времени 10 с.

Метод субстратной защиты состоял в следующем: Люциферазу (4,2 гмоль/л) смешивали с сульфо-SMCC (630 гмоль/л) в 10 ммоль/л буфера HEPES (рН 7,75), и полученную смесь инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Через рассчитанные промежутки времени образец удаляли из реакционной смеси и 100-кратно разводили в буфере, после чего измеряли люциферазную активность образца. Затем к смеси добавляли различные концентрации Мg²⁺-АТФ или D-люциферина и прослеживали их действие на люциферазную активность в целях определения концентраций субстрата, наиболее эффективных для защиты от ингибирования.

Ковалентное связывание с сульфо-SMCC: овечьи антитела IgG против рицина восстанавливали с высвобождением тиоловых групп посредством реакции с 2-меркаптоэтиламин-НСl, проводимой в течение 90 минут при 37^oС (см., инструкции к набору Pierce Warriner). Затем приготавливали раствор 4 мг люциферазы в 1 мл фосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 0,5 ммоль/л АТФ и 2,5 ммоль/л сульфата магния. После этого добавляли 50 мкл 20 ммоль/л сульфо-SMCC в фосфатном буфере (рН 6,0) и полученную смесь инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Активированную люциферазу очищали с использованием колонки для обессоливания с GF-5 Pierce, после чего активированную люциферазу и восстановленный IgG объединяли в соотношении 1:1 в фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 0,25 ммоль/л ЭДТК, 0,5 ммоль/л АТФ и 2,5 ммоль/л сульфата магния. Реакцию проводили в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем прекращали путем добавления 10 мкл 1 моль/л цистеина в течение 20 минут, после чего конъюгат "люцифераза-антитело" очищали на обессоливающей колонке с GF-5 Pierce. Полученный продукт хранили при 4^oС в натрий-фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 0,25 ммоль/л ЭДТК, вплоть до его использования.

Остаточную активность конъюгированной люциферазы оценивали с помощью анализа ELISA, описанного ниже.

Биолюминесцентный анализ ELISA на пробирках: Полистироловые пробирки сенсибилизировали в течение ночи при 4^oС 100 микролитрами рицина в карбонат-бикарбонатном буфере (рН 9,6), содержащем 0,02% тиомерсал. Конъюгат "люцифераза-антитело" разводили в забуференном фосфатном физиологическом растворе (PBs) и после блокирования пробирок 200 микролитрами 1%-ного BSA добавляли 100 мкл меченого антитела, а затем инкубировали в течение 1 часа при 37^oС. После этого пробирки пять раз промывали в PBs, содержащем 5% Твин 20. Затем в каждую пробирку добавляли 200 мкл субстрата и сразу после этого измеряли люминесценцию.

Результаты: Результаты, полученные из эксперимента по субстратной защите фермента с использованием Мg²⁺АТФ, представлены на фиг.1, где изображен график зависимости % остаточной люциферазной активности, измеренной с помощью люминометра, от времени; причем указанный график был построен путем удаления образцов (3 повтора для каждой точки) из реакционной смеси, которая содержала 0,63•10^-6 моль/л сульфо-SMCC; 4,2•10^-6 моль/л люциферазы и Мg²⁺-АТФ. На графике представлены кривые, полученные для реакции в отсутствии Мg²⁺ или АТФ и для реакции с использованием 0,03 ммоль/л АТФ и 0,2 ммоль/л Мg²⁺; 0,25 ммоль/л АТФ и 2 ммоль/л Mg²⁺; 0,25 ммоль/л АТФ и 2,5 ммоль/л Мg²⁺. Был также проведен анализ на защитное действие D-люциферина (не показано) и в результате этого анализа было установлено, что D-люциферин способствует некоторому сохранению люциферазной активности, но в гораздо меньшей степени, чем Мg²⁺АТФ. Максимальная тестированная концентрация D-люциферина, которая составляла 1 ммоль/л, обеспечивала после 30-минутного экспонирования с сульфо-SМСС 11%-ное сохранение от первоначальной люциферазной активности, тогда как использование Мg²⁺АТФ обеспечивало более чем 40%-ное сохранение активности.

Результаты биолюминесцентного анализа ELISA на пробирках представлены на фиг. 2. Полистироловые пробирки были использованы для измерения светового излучения, осуществляемого непосредственно в люминометре Multilite^®, однако в этих целях могут быть также использованы планшеты для микротитрования и люминометр на пластинах. Полученные результаты свидетельствовали о продуцировании активного конъюгата "люцифераза-антитело" и показали, что антитело сохраняет свои связывающие свойства.

Пример 2
Овечье поликлональное антитело против рицина ковалентно связывали с оптическим волокном, соединенным с фотоэлектронным умножителем, и участок оптического волокна, ковалентно связанный с антителом, помещали в камеру, в которую можно наливать и выливать, если это необходимо, различные растворы. Затем осуществляли анализ с проведением следующего цикла:
(i) в указанную камеру добавляли субстратный раствор, содержащий D-люциферин так, чтобы любая присутствующая люцифераза вызывала световое излучение;
(ii) субстратный раствор заменяли испытуемым образцом, содержащим рицин;
(iii) раствор испытуемого образца заменяли раствором, содержащим овечьи IgG против рицина, меченные люциферазой;
(iv) раствор овечьих антител против рицина заменяли субстратным раствором, содержащим D-люциферин;
(v) субстратный раствор заменяли восстановительным буфером.

Проведение анализа в соответствии с вышеуказанной схемой позволяет определить количество рицина в исследуемом образце путем измерения увеличения сигнала на выходе фотоумножителя в стадии (iv) по сравнению с предыдущим сигналом и оценки количества рицина с использованием стандартной кривой, построенной, исходя из данных увеличения сигнала для известных количеств рицина.

Способ конъюгирования люциферазы и меченых химических молекул, описанный в настоящей заявке, может быть использован для люцифераз, описанных в WO 9525798. Аналогичным образом этот способ может быть также использован для других люцифераз.

Изобретение относится к биотехнологии, касается способа конъюгирования люциферазы с химической частицей, в частности антителом, предусматривающий (а) смешивание люциферазы с одним или несколькими компонентами, такими как D-люциферин, ионы магния и аденозинтрифосфат, и (b) осуществление реакции ковалентного связывания между люциферазой и связывающим реагентом с использованием ковалентно связующего агента, где D - люциферин, ионы магния и/или аденозинтрифосфат присутствуют в количестве, достаточном для защиты активности люциферазы от ингибирования ковалентно связующим агентом. Стадию (а) осуществляют смешиванием люциферазы с ее субстратами, при этом предпочтительно, если магний и аденозинтрифосфат присутствуют в виде комплекса аденозинтрифосфата с магнием (Mg²⁺ - АТФ) необязательно вместе с D-люциферином. Во втором аспекте настоящее изобретение касается меченного люциферазой антитела, представляющего собой антитело, конъюгированное с активной люциферазой светлячка способом настоящего изобретения. Изобретение касается набора для применения в анализе на специфическое связывание с антигеном и способа его осуществления с использованием меченного люциферазой антитела. 4 с. и 16 з. п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ получения меченного люциферазой антитела, включающий в себя конъюгирование люциферазы светлячка с антителом путем (а) смешивания указанной люциферазы либо (i) с D-люциферином, либо (ii) с ионами магния и аденозинтрифосфатом (АТФ), либо (iii) с D-люциферином, ионами магния и АТФ, так чтобы концентрации ионов магния и АТФ, когда они присутствуют, составляли соответственно 0,2-2,5 ммоль/л ионов магния и 0,05-0,5 ммоль/л, и (b) проведения реакции ковалентного связывания между люциферазой и антителом с использованием ковалентно связующего реагента. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что люциферазу смешивают на стадии (а) с D-люциферином, ионами магния и АТФ и при котором кислород исключен из реакции ковалентного связывания (b). 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что стадию (а) осуществляют путем смешивания указанной люциферазы с D-люциферином, ионами магния и/или АТФ в растворе. 4. Способ по пп. 1, 2 или 3, отличающийся тем, что как указанные ионы магния, так и АТФ присутствуют в виде магнийаденозинтрифосфата (Mg²⁺АТФ). 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что стадию (а) осуществляют с использованием 0,2 ммоль/л или более АТФ в расчете на 4•6^-6 моль/л люциферазы. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что стадию (а) осуществляют в присутствии 2 ммоль/л ионов магния. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что ковалентно связующим реагентом являются глутаральдегид, сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) и/или сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (SMPB). 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что стадию (b) осуществляют с помощью ковалентно связующего реагента после смешивания люциферазы с реагентами (i), (ii) или (iii). 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что используют 0,5 ммоль/л АТФ. 10. Меченное люциферазой антитело, представляющее собой антитело, конъюгированное с люциферазой светлячка способом по пп.1-9. 11. Способ осуществления анализа на специфическое связывание, включающий в себя стадию связывания меченного люциферазой антитела, указанного в п.10, с антигеном. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что присутствие и/или количество химической частицы-мишени определяют путем ее специфического связывания с меченным люциферазой антителом по п.10, последующей обработкой связанной частицы D-люциферином в условиях, при которых люцифераза расщепляет D-люциферин и вызывает излучение света, и установления зависимости количества любого светового излучения от присутствия указанной химической частицы-мишени. 13. Способ по п.11 или 12, отличающийся тем, что химическая частица-мишень является антигеном и захватывается специфичным для этой мишени иммобилизованным антителом перед связыванием с меченным люциферазой антителом по п.10. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что иммобилизованное антитело конъюгируют с поверхностью световода или светодетекторной матрицы, подающих свет на фотоэлектрическое измерительное устройство, например, фотоумножитель. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что световодом является оптическое волокно. 16. Способ по п.14, отличающийся тем, что фотоумножитель используют для одновременного мониторинга ряда дискретных областей на поверхностях 1 или 2 пространственных детекторных матриц, причем каждая область имеет разные иммобилизованные антитела или антигены, специфичные для разных антигенов или антител соответственно, так, что присутствие конкретного антигена может быть обнаружено по положению детектируемого светового излучения. 17. Способ по п.15, отличающийся тем, что фотоумножителем является прибор с зарядовой связью (ПЗС). 18. Набор для применения в анализе на специфическое связывание по п.11, отличающийся тем, что содержит антитело, которое конъюгировано с активной люциферазой светлячка способом по любому из пп.1-10, и D-люциферин. 19. Набор по п. 18, отличающийся тем, что активность конъюгированной люциферазы светлячка составляет 10% или более от активности люциферазы светлячка, на основании которой было получено меченое антитело. 20. Набор по п.18, отличающийся тем, что содержит световод или светодетекторную матрицу, на которых иммобилизованы антитела.