Способ получения люциферазы светляков Советский патент 1987 года по МПК C12N9/02 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения люциферазы светляков.

Цель изобретения - увеличение активности и стабильности люциферазы и повышение ее концентрации в растворе.

Способ осуществляют следующим образом.

Лампочки светляков измельчают растиранием, которое целесообразно проводить в смеси с охлажденным карборундом, что повышает степень измельчения. Полученный порошок инкубируют в 0,1 М фосфатном или трис-ацетат- ном буферном растворе с рН 7,8. Используемый буферный раствор содержит О, 3-0,8 М минеральной соли, обычно используемой при работе с ферментами, например хлорид калия или натрия, азотнокислый натрий, а также 15-25% глицерина или 0,2-0,3 М сахарозы в качестве стабилизирующих люцифера- зу добавок. Соотношение лампочки светляков:буферный раствор 1:(8-30). Инкубирование ведут 12-24 ч при , Наличие в буферном растворе высокой концентрации соли и стабилизирующих добавок стабилизирует люциферазу и способствует более полному выделению фермента в раствор из исходного сырь При использовании концентрации соли и стабилизирующих добавок ниже указанных снижаются стабилизирующий эффект буферного раствора и степень извлечения фермента из исходного сырья. Использование концентраций выше максимальных не приводит к дополнительному положительному эффекту, однако повышает вязкость растворов и затрудняет работу при пониженной температуре. Использование при инкубировании более высокого соотношения лампочки светляков:буферный раствор, чем 1:30, приводит к разбавленным растворам фермента и снижению положительного эффекта изобретения, а при использовании соотношения менее, чем 1:8, приводит к неполному извлечению люциферазы из исходного сырья. Длительность инкубирования менее 12 ч приводит к неполному извлечению люциферазы, а при длительности инкубирования более 24 ч не достигается дополнительный положительный эффект, однако неоправданно увеличивается длительность всех операций получение люциферазы.

После инкубирования смесь центрифугируют при 3000g 5-15 мин для отделения раствора от осадка. Последний смешивают с новой порцией буферного раствора, перемешивают 20- 40 мин, вновь центрифугируют, затем обработку осадка повторяют. Три порции буферного раствора, содержащие

лю1 иферазу, объединяют и очищают от балластных веществ дифференциальным ультрацентрифугированием, сначала при 20000-30000g 15-45 мин, а затем при 14000g 1-2 ч. Получают надоса5 дочный раствор , который содержит люциферазу с активностью (3, 3-10) 10 мВ/мл и удельной активностью (l,6-13)i мВ/мг, Указанный режим дифференциального ультрацентрифугирова0 ния не является существенным признаком предлагаемого изобретения, а лишь предпочтительным, так как положительный зффект, т,е, повьш1ение активности и стабильности люциферазы,

5 может быть достигнут и при использовании других режимов дифференциального ультрацентрифугирования, а именно: при центрифугировании в одну стадию при 140-150 тыс, g в течение 3 ч, либо при центрифугировании в три или четыре стадии по 30 мин при 15, 50, 100 и 140 тыс, g. Однако во. всех этих случаях увеличивается продолжительность и трудоемкость процесса получения люциферазы.

В результате очистки методом дифференциального ультрацентрифугирования достигают 10-кратной очистки фермента от балластных веществ. Таким образом, получают препарат люциферазы, удельная активность которого в 200-2000 раз вьщ1е, чем активность препарата, получаемого по известному способу, а концентрация активной люциферазы вьш1е в 40-130 раз. Полученный по предлагаемому способу препарат люциферазы отличается высокой стабильностью. За счет стабилизирующего воздействия буферного раствора, используемого при выделении фермента, не происходит инактивация люциферазы в ходе очистки. Полученный препарат при 4° С хранят 30 дн , при этом активность люциферазы уменьшается только в 2-3 раза.

Пример 1, 2,2 г лампочек светляков растирают в смеси с 14 г карборунда 20 мин при 4°С, затем добавляют 5 МП охлажденного 0,1 М трис0

5

0

5

0

5

3

ацетатного буферного раствора, рН7, содержащего 0,6 М КС1, 20% глицерина и растирают еще 20 мин. Добавляют 17 мл того же буферного раствора и инкубируют 18 ч при С, Таким образом, соотношение лампочки светляков: буферный раствор 1:10. Смесь центрифугируют при 3000g 10 мин, отделяют раствор, к осадку добавляют 20 мл свежего буферного раствора того же состава, инкубируют 30 мин, вновь центрифугируют. Последнюю операцию инкубирования и центрифугирования повторяют. Три порции полученного надосадочиого раствора объединяют и центрифугируют 30 мин при 25000g, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость центрифугируют при lAOOOOg 1,5 ч. Получают надосадочный раствор который содержит люциферазу с активностью 1,0-10 мВ/мл и удельной активностью 13-10 мВ/мг белка. Степен очистки исходного экстракта после дифференциального ультрацентрифугиро вания .составляет 16 раз. При хранении при в растворе 30 сут. препарат сохраняет 50% активности. По известному способу получают препарат лютщферазы с активностью 7 ,5-10 мВ/мл удельной активностью 8-10 мВ/мг, Пр хранении препарата при 4 С он полностью теряет активность за 10 сут.

Пример 2, Способ осуществляют аналогично примеру 1, но инкубирование проводят в буферном растворе, содержащем 0,3 М NaCl, 10% глицерина при весовом соотношении лампочки светляков:буферный раствор 1:30 в течение 12 ч. Дифференциальное ультра- центрифугирование проводят сначала при 15000g 15 мин, а затем при 140000g 1 ч. Получают препарат люци- феразы с активностью 3-10 и удельной активностью 3,5-10 мВ/мг белка. При хранении в растворе при 4°С препарат сохраняет через 30 сут 35% активности.

Пример 3, Способ осуществляют аналогично примеру 1, но инкубирование проводят в буферном растворе, содержащем 0,8 М NaNO и 25% глицерина, при соотношении лампочки свет- лякор:буферный раствор 1:8 24 ч, а дифференциальное ультрацентрифугирование проводят 45 мин при 30000g, затем при 140000g 2 ч, Получают препарат люпиферазы с активностью 3,3 х10 мВ/мл и удельной активностью

Q 5 g 5 о

5

5

5

128

1,6.10 мВ/мг белка. Полученный препарат при хранении в растворе при 4°С через 30 сут. сохраняет 45% активности.

Пример 4, Все операции осуществляют аналогично примеру 1, но инкубирование проводят в буферном растворе, содержащем вместо глицерина различные концентрации сахарозы: 0,2, 0,25 и 0,3 М, Получают препараты люциферазы с активностями 5 10 -10 и 6 10 мВ/мл соответственно. Удельная активность пре- парат-а люциферазы, полученного при использовании 0,25 М сахарозы, 10 «10 мВ/мг белка. Степень очистки исходного зкстракта после дифференциального ультрацентрифугирования 16,5 раз. При хранении при 4°С в растворе через 30 сут препарат сохраняет 50% активности.

Пример 5. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но растирают лампочки светляков без карборунда и инкубирование осуществляют в 0,1 М фосфатном буферном растворе, Получают препараты люциферазы с активностью 0,5 10 мВ/мл. Препарат сохраняет 50% активности через 30 сут. хранения при 4 С.

Пример 6. Способ осуществляют аналогично примеру I, но ультрацентрифугирование проводят 3 ч при 150 тыс, g. Активность полученного препарата 0,7-10 мВ/мл. Препарат сохраняет 50% активности через 30 сут хранения при 4°С,

Пример 7. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но ультрацентрифугирование проводят последовательно при 15, 50, 100 и 140 тыс. g по 30 мин. Активность полученного препарата 0,540 мВ/мл. Препарат сохраняет 40% активности через 30 сут. хранения при 4 С,

Пример 8. Препарат, полученный аналогично примеру 1, используют для определения низких концентраций АТФ. Для этого в кювету для измерения .биолюминесценции помещают 0,9 мл 0,1М трис-ацетатного буферного раствора, рН 7,8, 0,1 МП О,1 М MgSO в том же буферном растворе, 0,15 мл раствора, содержащего АТФ, 0,2 мл раствора полученного препарата люциферазы, предварительно разбавленного в 30 раз буферным раствором указанного состава. Смесь перемешивают, помещают в кюветное отделение люмино- метра, измеряют фоновую интенсивност свечения 1фон« затем добавляют О, 15 мл 0,1 мМ люциферина в том же буферном растворе и измеряют интенсивность

Концентрация АТФ в измеряемой смеси, М

- -oJpciina

Полученные данные используют для построения калибр.овочной кривой для определения неизвестных концентраций АТФ.

Таким образом, предлагаемый способ получения люциферазы позноляет получать препараты люциферазы с удельной активностью, в 200-2000 раз превышающей активность известных препаратов, при этом концентрация люциферазы в растворе увеличивается в 40-130 раз.

Стабильность полученного растворимого препарата люциферазы в десятки раз превышает стабильность всех известных растворимых препаратов люциферазы. Дополнительным положительным эффектом предлагаемого способа получения люциферазы светляков является увеличение чувствительности определения АТФ с использованием полученного препарата люциферазы. Предел обнаружения АТФ с помощью полученного препарата М.

Форм у л а изобретения

1. Способ получения люциферазы светляков, предусматривающий измельчение лампочек светляков, инкубирование полученного порошка в буферном растворе, отделение твердого осадка и очистку от балластных веществ, о т личающийся тем, что, с цеСоставитель Т. Мелентьева Редактор И. Горная Техред М.Днцык Корректор И. Эрдейи

Заказ 4183/17 Тираж 499Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

свечения I. Разность I-I,,,, характеризует интенсивность свечения аналн-. зируемого образца АТФ . Используя растворы, содержащие различные концентрации АТФ, получают следующую зависимость:

10 10 «

10

5

0

5

0,8 1,А 3,8 39,4 326,4

лью увеличения активности и стабильности люциферазы и повышения ее концентрации в растворе, для инкубирования используют буферный раствор, содержащий О,-3-0,8 М минеральной соли, 15-25% глицерина или 0,2-0,3 М сахарозы в качестве стабилизирующих добавок, при этом массовое соотношение лампочки светляков:буферный раствор устанавливают 1:(8-30), а очистку от балластных веществ осуществляют дифференциальным ультрацентрифугированием.

2.Способ по п. 1,отличающий с я тем, что инкубирование осуществляют в течение 12-24 ч в 0,1 М трис-ацетатном буферном растворе.

3.Способ попп. 1и2, отличающийся тем, что дифференциальное ультрацентрифугирование проводят сначала при 20-30 тыс. g в те чение 15-45 мин, а затем при 140 тыс. g в течение 1-2 ч.

4.Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что лампочки светляков измельчают в смеси с карборундом.

5.Способ по п. I, отличающий с я тем, что в качестве минеральной соли используют хлорид ка ЛИЯ или натрия, или азотнокислый натрий.

0

0

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения люциферазы светляков. Цель изобретения - увеличение активности и стабильности люциферазы и повышение ее концентрации в растворе. Лампочки светляков растирают с карборундом, инкубируют в буферном растворе, содержащем 0,3-0,8 М минеральной соли, 15-25% глицерина или 0,2- 0,4 М сахарозы в качестве стабилизирующих добавок, при этом массовое соотношение лампо11ки светляков:буферный раствор составляет 1:(8-30). Осадок отделяют, а надосадочный раствор подвергают дифференциальному ультрацентрифугированию сначала 15-45 мин при 15-30 тыс. g, затем 1-2 ч при 140 тыс. g. Активность полученного раствора 1,0-10 мВ/мл, удельная активность 13 -10 мВ/мг белка. При хранении при 4°С в растворе в течение месяца препарат сохраняет 50% активности. 4 з.п. ф-лы. с (Л со со ( 00