Способ хроматографического анализа Советский патент 1980 года по МПК G01N31/08 B01D15/08 

Изобретение от нссится к аналитичес кому приборостроению, в частности к способам жидкостной хроматографии. В настоящее время все большее распространение получают способы хроматографии, осуществляемые в автоматических хроматографах с использованием программирующих ycтpoйcтв а так же управляемые способы хроматографического анализа. Известен способ хроматографического разделения, при котором хроматографическая колонка в первой своей части постоянно нагрета, а во второй температура распределена так, что он спадает до комнатной к концу колонки Во второй части колонки вещество: осаждается в виде узких зон. Для подачи их в детектор также в виде ysKH зон на колонку надета перемещающаяся цилиндрическая печь в направлении от выхода колонки к-ее входу, причем длина печи не меньше той части колон ХИ, в которой запрограммировано онижение температуры 1. Недостаткс1ми этого способа являются отсутствие возможности увеличения эффективности за счет воздействи на процесс разделения .веществ, так как нагревательная печь служит для отвода разделившихся веществ, осажденных в охлажденной части колонки; отсутствие возможности избирательного воздействия на произвольную хроматографическуто зону в столбе сорбента разделительной колонки; отсутствие возможности воздействия холодом в узкой зоне. Известен также способ хроматографического ансшиза, при котором анализируемую смесь подвергают хроматографическому разделению в системе подвижной и неподвижной фаз, регистрируют разделяемые компоненты с помощью детектора и управляют процессом хроматографического разделения по сигналу детектора 2. Известйый способ состоит в циркуляции смеси веществ по замкнутому контуру, заполненному хроматографической средой, до тех пор, пока по крайней мере часть составляющих компонентов указанной порции вещества не отделится от остальной зоны. К разделенным компонентам, циркулирующим в системе совместно с неразделившейся группой веществ, но немного впереди и позади основной массы, в

определенных точках замкнутого хроматографического устройства (системы, добсшляют транспортную жидкость с целью выпуска компонентов. Порции жидкости изменяют направление движения отделившихся компонентов и выводят их за пределы замкнутой хроматографической колонки. Отставание отделившейся компоненты Стимулируют также встречным потоком газа-носителя.

Этот способ является наиболее близким по технической сущности к изобретению. Однако в нем отсутствует возможность постоянно наблюдать картину распределения разделяемых веществ по длине хроматографической системы, что не позволяет своевременно вмешиваться в процесс разделения. Информация получается только один раз за время проходавсей зао4о нутой хроматографической Системы. Кроме того, воздействие на сам фактор (процесс) разделения сказывается только за счет создания буферных зон между разделившимися и неразделившимися компонентами. Этот способ воздействия не затрагивает совокупность элементарных миграционных процессов, ответственных за процесс хроматографического разделения. Отсюда время разделения существенно не сокращается по сравнению с незамкнутыми циклами.

Для повыгиения зффективности разделения разделяемые компоненты детектируют непосредственно в процессе хроматографического разделения на пути движения зон разделяемых компонентов и по результатам детектирования изменяют скорость передвижения зон в подвижной и/иди неподвижной Фазах путем изменения физико-химических параметров этих фаз .

Сканирование хроматографической системы (колонки,пластины) с тонким слоем, листы хроматографической бумаги, слоя геля и т.п. дает картину развития процесса резделения во времени, что позволяет принимать решения о вмешательстве в хроматографический процесс, воздействуя на скорость передвижения отдельных зон изменения физико-химических параметров подвижной и неподвижной фаз, а также изменяя природу анализируемого компонента, подвижную и неподвижную фазы.

Воздействие на скорость перемещения хроматографических зон производят путем изменения температуры в локальных зонах хроматографической системы, причем элементы, создающие тепловое поле, подвижны и движутся в соответствии с движением определенных зон по командам вычислительного устройства. Создаются узкие зоны нагрева и охлаждения. Воздействие на скорость перемещения хроматографических зон создается и оказывается также изменением скорости подвижной фазы в отдельных частях хроматографической

системы, а также путем изменения состава подвижной фазы.

Локальное температурное воздействие проводят при разделении пуриновых и пиримидиновых оснований, рибонуклеозилов и рибунуклеотидов на колонках (300 см X 1 мм), заполненньк гранулированными ионообменными смолами (типа полинекса SAX).

На фиг. 1 изображено одно из возможных устройств для осуществления предлагаемого способа с механическими элементами; на фиг. 2 дана гидравлическая схема другого возможного устройства.для осуществления способа; на фиг. 3 дана иллюстрация резултатов разделения смеси нуклеозид оофатов.

Кварцевая хроматографическая колонка 1 соединена трубкой 2 с системой 3 подачи градиента. Кольцевые холодильники-нагреватели 4 на основе элементов Пельтье, схватывающие колонку, подвижно укреплены на направляющих штангс1Х 5. С направляющими штангами .6 сочленено сканирующее устройство 7, имеющее автоматические захваты 8, работающие по командам управляющей вычислительной машины 9, детектор 10 ионизирующего излучения, систему валиков 11 для перемещения, источник 12 ионизирующего излучения в свинцовом коллиматоре и электродвигатель 13 типа РД-09 для перемещения устройства. С вычислительной управляющей Мсшшной 9 соединены систем 14 управления электродвигателем и программатор 15 температур с системой питания термоэлементов. При этом кольцевые воздействующие элементы имеют ширину активной зоны не более 1-5% длины колонки.

На гидравлической схеме экспериментального устройства (см. фиг. 2), подключенной к хроматографической.колонке 1, показана система вводов 16, подключенная к кранам - переключателям 17, соединенным через распределительный трубопровод 18 с дозатором 19 и насосами 20 градиентной системы со сменными сосуде та 21 с управляющим клапаном 22, а к приемному трубопроводу 23 подключен детектор 24, связанный с коллектором 25 фракций.

Действие устройства происходит следующим образом.

На хроматографическую колонку 1 по трубам 2 Подается элюент от системы 3 подачи элюента по командам управляющей в(з1числительной машины 9. Сканирующее устройство 7 совершает регулярные возвратно-поступательные движения по направляющим 6 с помощью реверсивного электродвигателя 13 и валиков 11, управляемого вычислительной машиной 9 через систему 14 упргшления электродвигателя.

Распределение кс тонетов анализируемой смеси по длине колонки определяется по результатам измерения по глощения Черенковского излучения, возникающего под действием ионизирую щего излучения источника 12 (°5г,3 100 мк Кюри, На основе анализа распределения компонентов смеси в колонке вдоль траектории движения зон вычислительная управляющая машина 9 отдает кома ды на ештсматические захваты 8, обес .печивающие соединение одного из воздействующих элементов холодильниковнагревателей 4, со сканирующим устрой ством 7 на заданное время перемещени по штангам 5.Одновременно вычислительная управляющая машина 9 задает режим питания перемещаемых воздействующих элементов холодильников-нагре вателей 4 через программатор 15 температур с системой питания термоэлементов . Элемент с отделенными зонс1ми удаляют через выводную трубку, Действие гидргшлической системы экспериментальной хроматографической системы (см. фиг. 2) происходит следующим образом. Сканирующее устройст во 7 регулярно совершает возвратнопоступательные движения вдоль хроматографической колонки 1 с выводами 16. Информация о распределении компо нентов анализируемой смеси передаетс на вычислительную управляющую машину 9, которая в свою очередь управляет насосами 20 и кранами-переключателями 17, Каждый из боковых выводов 16, расположенных в различных зонах колонки 1, может быть использован как вход или как выход. Пробу вводяв через дозатор 19 в распределительный трубопровод 18 и подают в начало колонки (зона ввода Г), Производят гра диентное элюирование по обычной схеме, а также непрерывное сканирование колонки. Информация обрабатывается вычислительной управляющей машиной 9 Для детального разбора работы экспериментальной установки ниже рас сматриваются несколько типичных слу чаев . Случай А, Один из хроматографичес ких пиков отделяется от основной группы и находится, например, между эонамк ввода III и IV (сканер показывает, что пик прошел зону ввода III), Вычислительная управляющая машина в этом случае ,отдает ряд команд и производит операцию запоминания производительности насосов А и В в момент переключения. Через ввод 16 в зоне ввода III в колонку начинают подавать концентрированный раствор с помощью насоса В, а насос А останавливают. После того, как пик выходит из колонки (т.е. выходит из паля зрения) градиентная система возвращается в состояние, наблюдаемое в мо мент переключения для быстрого смыва пика. Случай Б. Один или несколько пиков отделяются от основной группы неразделившихся пиков и неосодятся, например, в том же отрезке колонки между зонами ввода II и III. Когда основная группа веществ проходит зону ввода III, через него начингиот подавать градиентный раствор постоянной концентрации, именно той концентрации, которая подается в момент переключения. При этом Bdsxos. из колонки перекрывают, а раствор выводят через трубку в зоне ввода II. После того, как пик (или пики) покидают колонку, система возвращается в прежнее состояние, а элемент из смесителя с нарастающей концентрацией вводят через трубку в зоне ввода III. Случай В. По данным сканирования определяется, что группа анализируемых веществ прошла зону ввода II, а разделение было недостаточным, в этом случае меняют состав элюента (автоматически заменяют сосуд Б на сосуд с другой жидкостью) и новый элюент начинают подавать в колонну в зоне ввода III. Вывод из колонки осуществляют через соединения в зонах ввода I и V. в момент, когда по результатам сканирования становится ясно, что началось заметное изменение границ зоны неразделившихся хроматографических пиков, подачу элемента и наращивание его концентрации продолжают, но уже в зоне ввода II, а зону ввода I перекрывают. Пример.. Производят хроматографическое разделение. 5 мг смеси нуклеозидфосфатов на ионообменной целлюлозе (ДЭАЭ) в градиенте концентрации триэтиламонний бикарбоната (ТЭАБ), Диаметр колонки 5 мм, длина 300 MMf материал колонки -кварц. На фиг. 3-а представлена запись, полученная на установленном на выходе колонки спектрофотометрическом детекторе СФД-3 в общепринятом варианте проведения хроматографического анализа, т.е. без воздействия на скорость передвижения хроматографических зон каким либо способом. На фиг, 36 показаны результаты разделения той же смеси нуклеозидфосфатов при воздействии на скорость передвижения отдельных зон в следующей последовательности; 1) зона первого пика, обнаруженного при сканировании после его отделения от основной массы неразделившихся компонентов, подвергалась нагреву кольцевым воздействующим элементом, связанным с подвижным устройством только во время прохождения области колонки от ее конца до отделяющегося пика, и в остальное время остающимся в зоне пика подключенным к источнику питания, обеспечивающему поддержание

постоянной температуры элементов 605« С;

2)зона второго пика воздействию не подвергалась;

3)зона третьего пика подвергёшас охлаждению для улучшения его разделения с остальной массой уходящих вперед компонентов, для чего управляющая система при каждом возвратнопоступательном движении подвижного устройства корректировала положение воздействующего элемента так, чтобы положение начала пика совпадало с охлаждаемой зоной, причем корпус колонки в охлажденной зоне имел пёратуру 3-5°С.

Из сопоставления кривЕлх на фиг.З, 4 нетрудно определить, что эффективность хроматографического разделения :возросла в 4, 7 раза. Правда, нельзя не отметить, что время удержания последнего компонента было произвольно увеличено, и тем самым возросло общее время анализа. Однако было достигнуто полное разделение двух последних компонентов.

Формула изобретения

Способ хроматографического анализа,, при котором ансшизируемуго смесь подвергают хроматографическому разделению в .системе подвижной и неподвижной фаз, регистрируют разделяемые компоненты смеси с помощью детектора и управляют процессом хроматографического разделения по сигналу детектора, отличающийс я тем, что, с целью повышения эффективности разделения, разделяемые компоненты детектируют непосредственно в процессе хроматографического разделения на пути движения зон разделяемых компонентов и по результатам детектирования изменяют скорость передвижения зон в подвижной и или неподвижной фазах путем изменения физикo-xи ичecкиx паС аметров этих фаз.

Источники информгщии, принятые во внимание при экспертизе

1.Патент Японии № 50-33434, кл. 113 (С) 1, 1975.

2.Патент США 3.455.090, кл. 55-67, 1969 (прототип).