Способ получения межвидовых гибридных форм картофеля Советский патент 1980 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к.селекции сельскохозяйственных растений, в частности картофеля. Известны способы гибридизации со матических клеток, при которых для смешения изолированных протопластов используют различные культураль ные среды, например, Линсмайера и Скуга {. Однако применение этих сред не .дает возможность получать растения картофеля. Известен также способ, при котором получают соматические гибриды между Nicotiana glauca и Nicotiana langsdorfii путем использования простой сахарозно-минеральной среды без добавления экзогенных факторов. Однако использование для селекции гибридных клеток среды без гормональных добавок перспективно для отбора тех комбинаций, которые характеризуются способностью к опухолеобразованию, что значительно сужа ет рамки получения соматических гиб РИДОВ у других сельскохозяйственных растений, в Частности картофеля, так как не обнаружена до настоящего времени гормонезависимость. При этом можно повторить только то, что уже получено половым путем. Целью настоящего изобретения является устранение барьера несовместимости и ускорение получения межвидовых гибридных форм картофеля. Цель достигается тем, что слияние протопластов производят с помощью полиэтиленгликоля с молекулярным весом 1500-2000 в концентрации 40-50%; для отбора гибридного продукта используют модифицированную среду Мурасиге и Скуга, применяют двухступенчатую систему индукции марфогенеза и технику ткани-няньки . Способ осуществляют следующим образом. Свежеизолированные в стерильных условиях с помощью 3,5-4,0% раствора фермента ксиланаза протопласты из культуры ткани одного вида картофеля, например Solanum tuberodum L., сорта Приекульский ранний (2п-5-4х 48) и с помощью 2,0-2,5% раствора того же фермента протопласты из мезофилла листа другого вида картофеля, например Solanum -сЬасоеь зе Bitt. (2п 2х 24) в О,3-0,4. М

растворе D-манннта смешивают в соотношении 1:1.

Суспензию изолированных протоплас тов приведенных видов картофеля осаждают центрифугированием (70110 g в течение 3-4 мин) и ресуспендируют с помощью 0,16-0,17 М раствора Ca(NO).2. до плотности 8 , -110 прот/мл.

В стерильных условиях, например в микробиологических боксах, помещают 3-4 капли смешанной суспензии изолированных протопластов двух видов картофеля на гладкое стекло, наприме .покровное стекло. Для уменьшения испарения покровное стекло предварително помещают в закрытую посуду, например чашки Петри (60 11 мм).

Через 3-5 мин (когда протопласты осядут) осторожно по краям добавляем 8-11 капель 40-50%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярным весом 1500-2000,

По истечении 15-25 мин культивирования полиэтиленгликоль удаляют с помощью остроконечной пипетки, на-, пример пастеровской пипетки, и суспензию осторожно промывают 1-2 раза 0,16-0,17 М раствором Ca(NO)2 -и 1-2 раза жидкой культивационной средой, например Мурасиге-Скуга.

Отмытую суспензию протопластов запивают теплой модифицированной культивационной средой, например Мурасиге-Скуга (макромикросоли, Ре - хелат - по М-С, В- - 2,0 мг/л BU -.0,8 мг/л, 2,4 Д - 1,0 мг/л, ( - нафтилуксусная кислота (НУК) 1,0 мг/л, 6 - бензиламинопурин (БАП) - 1,0 мг/л, сахароза - 25 г/л, маннит - 0,32 М бактоагар Difco 0,4-0,6%, рН 5,4-5,7%.

Посуду заклеивают пленкой, например парафином, инкубируют во влажной камере при 24-26°С и 16-18-часовом фотопериоде (500-700 лк).

Схема селективного отбора гибридных продуктов основана на отсутствии деления клеток одного из партнеров, например S.chacoense, и подавлении морфогенеза у другого партнера, например S.tuberostim.

Во время инкубирования слившиеся гибридные протопласты образуют клетоную стенку и в ходе делений дедифференцйруются,

Полученную через 2-3 недели каллусную ткань величиной около 1 мм вместе с бЛоками агаровой среды 1Q X 5 мм вырезают и высаживают на ту жф.среду, но без Д-маннита. Инкубируют их во влажной камере при 24-26°С и 16-18-часовом фотопериоде 1500-2000 лк,1-2 недели.

.Сформировавшуюся каллусную ткань картофеля (размером 2-3 мм) пассажИ руют на среду для морфогенеза (минеральная основа среды Мурасиге-Скуга; B-f - 0,6 мг/л; мезоинозит - 100 мг/л

БАП - 5,0 мг/л; НУК 1 мг/л; сахароза - 2,5 г/л, агар - 7 г/л; рН 5,6-5,8).

Для усиления процессов метаболизма каллусной ткани применяют технику ткани-няньки. С этой целью рядом с полученной тканью помещают кусочки другой дифференцированной ткани картофеля, например сеянца 9718 с/70 (Украинский НИИ картофельного хозяйства).

После 1-2 недель культирования каллуснуюткань переносят на ту же среду, но с уменьшенным количеством гормональных добавок (БАП - 0,3 мг/л НУК - 0,1 мг/л), где зачаточные стеблевые почки через 3-4 недели развишаютсЯ в стебельки.

Таким образом, полученные побеги картофеля отделяют от каллусной ткани и переносят для укоренения на среду,, разработанную в лаборатории оздоровления Украинского НИИ картофельного хозяйства.

Размножают растения черенкованием in vitro и пересаживают в почву уже гибридные растения межвидового проис хождения.

Эффективность предлагаемого способа заключается в устранении барьера несовместимости между видами, в получении межвидовых гибридных форм сельскохозяйственных растений, в частности картофеля. Способ дает возможность получать гибридные комбинации, образование которых половым скрещиванием невозможно, а именно цибридные растения (имеют гибридную цитоплазму и ядро одного из партнеров). Кроме того, способ относительно простой и доступный, не нуждается в дорогостоящем и дефицитном оборудовании, ферментах и реак.тивах.

Формула изобретения , Способ получения мeжвидoвыk гибридных форм картофеля, включающий слияние изолированных протопластов и культивирование их на питательных средах, отличающийсятем, что, с целью устранения барьера несовместимости и ускорения получения межвидовых гибридных форм, изолированые протопласты перед слиянием обрабатывают раствором полиэтиленгликоля с молекулярным весом 15002000 в концентрации 40-50% в течение 15-25 мин при комнатной температуре, после чего промывают один-два раза 0,16-0,17 М раствором азотнокислого кальция, а после слияния, культивируют на модифицированной среде Мурасиге-Скуга до образования каллуса, который пассажируют сначала на обогащенную фитогормонами среду Мурасиге-Скуга с применением техники ткани-няньки;, а затем на ту же среду, но с меньшим количеством

Ь731931 б

гормонов до появления гибридных по-2. Патент США 3832801,

бегов, которые пересаживают в почвукл. AOlG 31/00, 1965. (прототип5,

и укореняют.3. Остапенко Д.П., Прокопчук Н.Г.

Источники информации,рплив складу поживногосередовища

принятые во внимание при экспертизена picT рослин картогш in vitro.1. Linsmaier Е.М., Scoog F. Plant. Сб. Картоплярство , Киев, 1978,

Physiology 18, 100-127, 1965. В. 9 (методика).