Способ получения каллусной ткани бегонии краснолистной Советский патент 1991 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания пересадочных культур растительных тканей и может быть использовано в сельском хозяйстве, в частности цветоводстве закрытого грунта и медицинской промышленности.

Целью изобретения является повышение интенсивности каллусообразования.

Способ состоит в том, что стерильные эксплантаты молодых листьев бегонии крас- нолистной помещаются на мостики из обез- золенного фильтра, помещенного концами в модифицированную жидкую питательную среду: минеральные соли и микроэлементы по Мурасиге и Скугу, витамины, мг/л: пири- доксин 0,1; тиаминО,1, никотиновая кислота 0,5; инозитол 40; сахароза 3%; 6-БАП 1; 2,4-Д 1; с последующей инкубацией при 25°С в условиях непрерывной темноты.

Пример 1. В качестве эксплантатов используют сегменты молодых листьев бегонии, содержащие паренхиму, проводящие ткани и камбий, которые показали в ходе изучения способности эксплантатов различного происхождения высокую эффективность каллусообразованичя (90%). Оптимальный вариант размера листового эксплантата 1,0x1,0 см (эффектиность каллусообразования 90%). Стерилизацию тканей проводят 0,1%-ным раствором диацида в течение 30 мин с последующим 5-кратным промыванием в стерильной дистиллированной воде (выход стерильных эксплантатов 82-87%). Индукцию каллуса листовых эксплантатов проводят на модифицированной питательной среде следующего состава, мг/л:

Макроэлементы: натрий фосфорнокислый однозамещенный170

азотнокислый аммоний1650

кальций хлористый440

калий азотнокислый1900

магний сернокислый370

калий фосфорнокислый однозамещенный170

железо сернокислое закис- ное27,8

(Л

о о

N 00 Ј

2 ЕДТА37,3

Микроэлементы:

борная кислота6,2

марганец сернокислый22,3

цинк сернокислый8,6

калий йодистый0,83

хлорид кобальта0,025

купорос медный0,025

натрий молибденовокислый 0,25 Витамины:

пиридоксин0,1

тиамин0,1

никотиновая кислота0,5

инозитол-40

сахароза30000

6-БАП1

2,4-Д1

В тщательно вымытую и высушенную посуду (химические пробирки) с фильтровальными мостиками разливают по 150 мл питательной среды. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками, автоклавиру- ют в автоклаве для уничтожения микроорганизмов при 0,7-0,8 атм 15 мин. Бокс стерилизуют бактерицидными лампами. Инструменты стерилизуют в суховоздуш- ном шкафу при 180°С, завернутые в бумагу Крафт. Также стерилизуют чашки Петри. В боксе перед началом работы инструменты опускают в спирт и обжигают в пламени спиртовки. Стерильные листовые эксплантаты помещают на фильтровальные мостики в пробирки. Пробирки содержат в термостате при 25°С в условиях непрерывной темноты. Спустя 15 дней на эксплантатах отмечается индукция каллусной ткани. Через две недели каллусную ткань вместе с первичным эксплантатом пассируют на ага- ризованную питательную среду для дальнейшего культивирования.

Примеры 2 12. Получение ткани проводят аналогично примеру 1, различиями являются модификации питательных сред.

Результаты испытания 12 модификаций питательных сред на основе среды Мураси- ге и Скуга представлены в таблице 1.

Образование каллуса отмечают по краям всего периметра высечки эксплантата, в местах поранения мезофилла. Каллус, разрастаясь, покрывает весь эксплантат (варианты 1 и 3). Интенсивность роста каллуса высокая на средах 1/2 и 3/2, на остальных средах ниже. Не отмечено избирательного отношения к сахарам. Каллус хорошо образуется на средах, содержащих как сахарозу, так и глюкозу. Добавки 6-БАП и 2,4-Д являются более действенными, чем 6-БАП и а- НУК. В то время как в вариантах 1 и 3 с 6-БАП и 2,4-Д каллус образуется на первом

этапе недифференцированным и только спустя 30 дней начинается ризогенез; в вариантах 2 и 4 сочетания 6-БАП с а - НУК количество эксплантатов, образовавших каллус и дающих сразу же ризогенез, превысит 90%,

Предлагаемый способ позволяет сократить срок калусогенеза: жидкая модифицированная питательная среда 15 дней; агаризованная модифицированная питательная среда 30 дней, по сравнению с известной агаризованной питательной средой Мурасиге и Скуга 38 дней. Повышается эффективность каллусообразования эксплан- татами, % эксплантатов, образовавших каллус: жидкая модифицированная питательная среда (в условиях непрерывной темноты) 91,5; агаризованная модифицированная питательная среда (в условиях 24- часового фотопериода) 5,0, по сравнению с известной агаризованной питательной средой Мурасиге и Скуга в условиях 24-часо- вого фотопериода (2%). Кроме того, улучшаются качественные характеристики каллусообразования, %;

жидкая модифицированная питательная среда:

обильных18,5

хороших 29,6

средних28,5

агаризованная модифицированная питательная среда:

обильныхО

хороших33,3

средних37,0

В известной агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга по мере образования каллусной ткани происходит быстрая пролиферация.

Формула изобретения

1. Способ получения каллусной ткани бегонии краснолистной, включающий культивирование стерильных эксплантатов на питательной среде, приготовленной на основе среды Мурасиге-Скуга, в темноте, отличающийся тем, что, с целью повыше- ния интенсивности каллусообразования, культивирование проводят в жидкой питательной среде на основе среды Мурасиге- Скуга с использованием мостиков из обеззоленного фильтра в присутствии пири- доксина в количестве 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л; никотиновой кислоты 0,5 мг/л, инозитола 40,0 мг/л, 6-бензиламинопу- рина.1.0 мг/л, натриевой соли дихлорфе- нилуксусной кислоты 1,0 мг/л, при содержании сахарозы 30000 мг/л среды.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что, в качестве эксплантатов использу.ют сегменты молодых листьев размером 1,0x1,0см.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию растительных тканей, и может применяться в садоводстве и фармакологии. Целью изобретения является повышение интенсивности каллусообразования. Способ состоит в том, что листовые сегменты бегонии краснолистной культивируют в темноте на жидкой модифицированной питательной среде Мурасиге-скуга с использованием мостиков из обездоленных фильтров. 1 табл. 1 з.п.ф-лы.

/1 Минеральные соли и элементы по Мурасиге и Скугу

Витамины, мг/л: пиридоксин 0,1 тиамин О,1

никотиновая кислота 0,5 инозитол 40 сахароза 30000 6-БАП 0,5 2,4-Д 0,5

/2 Минеральные соли и элементы по Мурасиге и Скугу

Витамины, мг/л: пиридоксин 0,1 тиамин 0,1

никотиновая кислота 0,5 инозитол 40 сахароза 30000 6-БАП 1 2,4-Д 1

/3 t Минеральные соли и элементы по Мурасиге и Скугу

Витамины, мг/л: пиридоксин 0,1 тиамин 0,1

никотиновая кислота 0,5 инозитол 40 сахароза 30000 6-БАП 1,5 2,4-Д 1,5

/1 Минеральные соли и элементы по Мурасиге и Скугу

Витамины, мг/л: пиродоксин 0,1 тиамин 0,1

4--М+++++

++++

++.+

716648418

Продолжение таблицы

-™ - ««« .« v v«««- j | «.« и.

никотиновая кислота 0,5 инозитол 40 сахароза 30000 6-БАЛ 0,5 мг/л d-НУК 1 мг/л

/2 Минеральные соли и элементы

по Мурасиге и Скугу++++

Витамины, мг/л: пиридоксин 0,1 тиамин 0,1

никотиновая кислота 0,5 инозитол 40 сахароза 30000 6-БАЛ 1 СА-НУК 2

/3 Минеральные соли и элементы

по Мурасиге и Скугу+++

Витамины, мг/л:

пиридоксин 0,1

тиамин 0,1 никотиновая кислота 0,5

инозитол 40

сахароза 30000

6-БАП 1,5 3,0 /1 Минеральные соли и элементы

по Мурасиге и Скугу+++

Витамины, мг/л:

пиридоксин 0,1

тиамин 0,1

никотиновая кислота 0,5

инозитол 40

сахароза 15000

глюкоза 15000

6-БАП 0,5

2,4-Д 0,5

g1664841 °

Продолжение таблицы

iZiiizzizziEizi

/2 Минеральные соли и элементы

по Мурасиге и Скугу+++++

Витамины, мг/л: пиридоксин 0,1 тиамин 0,1

никотиновая кислота 0,5 инозитол 40 сахароза 15000 глюкоза 15000 6-БАП 1 4-Д 1

/3 Минеральные соли и элементы

по Мурасиге и Скугу++++

Витамины, мг/л: пиридоксин 0,1 ткамин 0,1

никотиновая кислота 0,5 инозитол 40 сахароза 15000 глюкоза 15000 6-БАП 1,5 2,4-Д 1,5

/1 Минеральные соли и элементы

по Мурасиге и Скугу+-МВитамины, мг/л: пиридоксин 0,1 тиамин 0,1

никотиновая кислота 0,5 инозитол 40

сахароза 15000к

глюкоза 15000 6-БАП 0,5 А-НУК 1

/2 Минеральные соли и элементы

по Мурасиге и Скугу++++

Витамины, мг/л: пиридоксин 0,1

11

тиамин 0,1

никотиновая кислота 0,5 инозитол 40 сахароза 15000 6-БАП 1 2

/3 Минеральные соли и элементы

по Мурасиге и Скугу+++

Витамины, мг/л: пиридоксин 0,1 пиридоксин 0,1 никотиновая кислота 0,5 инозитол 40 сахароза 15000 о глюкоза 15000

6-БАП 1,5 (Х-НУК 3,0

1664841

12

Продолжение таблицы

ъ