СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛНОЦЕННЫХ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ТЮЛЬПАНОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЕМ СЕМЯПОЧЕК IN VITRO Российский патент 2006 года по МПК A01H4/00 A01H5/00 

Описание патента на изобретение RU2273987C2

Способ относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к способу культивирования in vitro изолированных семяпочек растений, и может быть использован для выполнения работ по практической селекции и семеноводству тюльпанов, а также при разработке более совершенных методов селекции этой ценной промышленной цветочной культуры в условиях in vitro - гаплоидии, полиплоидии, клеточной селекции.

Наиболее эффективными методами формообразования у тюльпанов считаются отдаленная гибридизация и разноплоидные скрещивания, при которых очень часто наблюдаются проявления генеративной несовместимости, что мешает формированию полноценных гибридных семян.

Исследование совместимости родительских форм и причин плохой завязываемости семян тюльпанов при межвидовых и разноплоидных скрещиваниях люминесцентно-микроскопическим методом (Братухина Е.В, 1997) показало, что во всех изученных комбинациях барьерные моменты несовместимости морфологически четко не обозначены. Тюльпанам свойственна случайность, неспецифичность нарушений, которая проявлялась на всех этапах прогамной фазы (на рыльце, в столбике, в каналах завязи), как и в вариантах, наблюдаемых у ячменно-ржаных гибридов.

Кроме того, нормальное проникновение мужских гаметофитов в пестики не может служить надежным критерием полной совместимости родительских форм. Нарушение оплодотворения нередко может обнаруживаться только при созревании плодов.

В результате исследований, проведенных в 1993-1996 гг., нами разработан "Способ получения микролуковиц тюльпанов из изолированных зародышей в условиях in vitro (патент № 2123256 Россия МПК6 A 01 4/00, Бюл. 35 - М., 1998 г.).

Вместе с тем было выявлено, что возможности использования метода изолированных зародышей на культуре тюльпана ограничены. По характеру развития зародыша тюльпан выделен в особую группу - эмбриогенез с замедленной дифференциацией зародыша. Извлечь эмбрион из незрелых семян удается лишь на 53-55 день после опыления, когда они достигают размера не менее 1-1,5 мм, в то время как приостановка их развития в несовместимых комбинациях скрещивания может наступить на 15-40 день после опыления.

За последние 10-20 лет опубликован целый ряд работ, касающихся технологии сохранения эмбрионов различных растений через культуру семяпочек (F.Kishi, Y.Kagami, M.Shinohara S.Hatano, 1994; F.S.Rangan, 1984).

Однако аналоги способа получения полноценных растений тюльпанов из семяпочек нам не известны. По M.G.M.Van Creij, D.M.F.J.Kerckhoffs & J.M.Van Tuyl (1999), стадия развития эмбриона, возможность его изоляции и переноса вместе с семяпочкой in vitro зависит от условий культивирования растений in vivo.

Метод получения полноценных растений тюльпанов из семяпочек, изолированных на ранней стадии развития эмбрионов, разработан в нашей стране впервые.

Цель изобретения - через культивирование семяпочек in vitro повысить жизнеспособность зародышей на возможно ранней стадии их развития, сохранить уникальные новообразования полиплоидных и межвидовых гибридов с одновременным увеличением их коэффициента размножения в ювенильном возрасте.

Поставленная цель достигается культивированием изолированных семяпочек тюльпанов в условиях in vitro в 3 этапа, каждый из которых отличается использованием определенной питательной среды, температурным и световым режимом.

Семяпочки через 5 недель после опыления (НПО) изолируют от материнского растения с частью завязи и высаживают в чашки Петри на агаризованную половинную питательную среду Мурасиге и Скуга с содержанием 9% сахарозы, дополненную глицином 2 мл/г, α-нафтилуксусной кислотой 1 мг/л, антибиотиком ампициллином 100 мг/л (фиг.1). Семяпочки культивируют в течение 16-17 недель в темноте, при температуре не выше +20°С. По мере разрастания и увеличения в размере семяпочек их выделяют из завязи и переносят в чашки Петри на свежую питательную среду того же состава, уменьшая содержание сахарозы до 3%. Культивируют 9-12 недель в темноте при температуре +5°С (фиг.2).

Семяпочки, изолированные с плацентой через 7 недель после опыления (НПО), высаживают на половинную агаризованную питательную среду Мурасиге и Скуга того же состава, что и пятинедельные, но с 3%-ной концентрацией сахарозы. Культивируют 4 недели в темноте при температуре +20°С.

Сформировавшиеся зародыши размером до 1,5 мм извлекают из семяпочек, переносят на питательную среду Ван Гофа и выращивают в течение 2-3 недель при температуре 22-25°С, освещенности 2-3 тыс. лк, 16-часовом фотопериоде. Разросшиеся семинедельные семяпочки, из которых после 4 недель культивирования невозможно извлечь зародыши (они размером менее 1 мм), переносят на питательную среду того же состава и содержат еще 9-12 недель в темноте при температуре +5°С для стимулирования прорастания зародышей.

Проростки, полученные из семяпочек 5 и 7 НПО, переносят на модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга с содержанием регуляторов роста α-нафтилуксусной кислоты - 0,15 мг/л, 6-бензиламинопурина (6-БАП) - 3,0 мг/л и 6% сахарозы. Культивируют при температуре +23-25°С, освещенности 2-3 тыс. лк, 16-часовом фотопериоде в течение 12-20 недель. Это дает возможность получить от одного эмбриона от 5 до 15 растений-регенерантов размером до 30 мм ( фиг.3, 4, 5).

Пример получения растений-регенерантов тюльпанов из изолированных семяпочек в условиях in vitro, осуществляемого в 3 этапа, показан на комбинации Уайт триумфатор×смесь пыльцы, Куин оф Найт×смесь пыльцы, Крисмэс Марвел×смесь пыльцы.

1 Этап - введение семяпочек in vitro:

а) изоляция семяпочек от материнского растения через 5 НПО с частью завязи и перенос на 3 варианта питательной среды с 9%-ной сахарозой, культивирование 16-17 недель в темноте при температуре +20°С;

б) изоляция семяпочек от материнского растения через 7 НПО на 2 варианта питательной среды с 3%-ной сахарозой, культивирование 4 недели в темноте при температуре +20°C.

Активность развития семяпочек на первом этапе культивирования устанавливалась по степени разрастания эндосперма, таблица 1, фиг.1.

Таблица 1.
Развитие пяти- и семинедельных семяпочек тюльпанов через 16 недель культивирования in vitro.
Вариант питательной средыВысажено семяпочек in vitro, шт.% разросшихся семяпочек5НПО7НПОI300-66,7II100-90,0III100-0IV-15053,3V-10048,3

Лучшей питательной средой на 1 этапе культивирования для пятинедельных семяпочек с частью завязи оказался вариант II (половинная Мурасиге и Скуга с 9%-сахарозой), а для семинедельных семяпочек - вариант IV (половинная Мурасиге и Скуга с 3%-ной сахарозой).

2 Этап - перенос разросшихся семяпочек на половинную питательную среду Мурасиге и Скуга с исходным содержанием регуляторов роста, 3%-ной сахарозой и культивирование их в темноте при температуре +5°С в течение 9-12 недель с целью получения проростков. Результаты экспериментов представлены в таблице 2, фиг.2.

Таблица 2.
Развитие эмбрионов тюльпанов на вторичной питательной среде (24 недели культивирования in vitro)
Комбинация скрещиванияСрок изоляции семяпочек(НПО) Высажено семяпочек, штукПроросло эмбрионов через 8 недель холодной обработкиштук%Уайт триумфатор×см.п.313021,50Уайт триумфатор×см.п.5290103,45Уайт триумфатор×см.п.780911,25Куин оф Найт×см.п.310022,00Куин оф Найт×см.п.515521,30Куин оф Найт×см.п.74812,10

3 Этап - перенос зародышей, развившихся из пяти- и семинедельных семяпочек, на модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга, содержащую в качестве регуляторов роста 6-бензиламинопурин (6 БАП) от 2,0 до 3,0 мг/л и α-нафтилуксусную кислоту (НУК) от 0,1 до 0,2 мг/л, сахарозу 3-6% при световом режиме 16/8 и температуре +23-25°С. Влияние совместного действия ауксинов и цитокининов на развитие регенератов из изолированных зародышей тюльпанов оценивалось по выходу полноценных растений после культивирования in vitro и по образованию дополнительных побегов, таблица 3, фиг.3.

Таблица 3.
Выход регенерантов тюльпанов in vitro в зависимости от концентрации регуляторов роста в питательной среде (Крисмэс Марвел×смесь пыльцы)
Концентрация регуляторов роста, мг/лВысажено зародышей, шт.Получено регенерантоввсего, шт.%Дополнительных побегов, %Полноценных растений, %Контроль(без регуляторов роста)20315,0066,76БАП-2,0+НУК-0,152145214,3114.380,06БАП-2,0+НУК-0,202141195,295.276,96БАП-З,0+НУК-0,152149233,3133,389,86БАП-3,0+НУК-0,202146219,0119,078,3

Наилучшее развитие регенерантов и образование дополнительных побегов получено с регуляторами роста 6 БАП-3 мг/л плюс НУК-0,15 мг/л при содержании в питательной среде 6% сахарозы (табл.4).

Таблица 4.
Выход регенерантов тюльпанов in vitro в зависимости от концентрации сахарозы (среда М-С модифицированная, комб. Крисмэс Марвел×смесь пыльцы)
Концентрация сахарозы в питательной среде, %Высажено зародышей, шт.Получено регенератовСредняя длина растений, ммштук%318633,34,65181161,18,56181688,912,17171588,210,4918738,93,9

Исходя из полученных данных, наиболее ранним сроком изоляции семяпочек от материнского растения для введения in vitro является 5 недель после опыления, показавшим наилучшие результаты, табл.5.

Таблица 5.
Выход регенерантов тюльпанов in vitro при разном сроке изолирования семяпочек от материнского растения
Комбинация скрещиванияСрок изоляции (НПО)Высажено семяпочек, шт.Перенесено на вторичную питательную средуПолучено регенерантовштук%штук%Уайт триумфатор×см.п.340013032,510,8Уайт триумфатор×см.п.540029072,58629,6Куин оф Найт×см.п.360010016,700Куин оф Найт×см.п.550015531,03723,9

Предложенный способ культивирования семяпочек in vitro позволяет обеспечить сохранность гибридных эмбрионов на ранней стадии их развития (через 5 недель после опыления), увеличить коэффициент размножения в ювенильном возрасте и значительно ускорить селекционный процесс, продолжающийся у тюльпанов около 25 лет. Кроме того, этот метод позволяет сохранить оригинальные образцы генотипов от единичных эмбрионов, полученных при отдаленных и разноплоидных скрещиваниях.

В целом заявленный способ дает возможность управлять селекционным процессом для получения сортов тюльпанов по заданным признакам.

Похожие патенты RU2273987C2

название год авторы номер документа
Способ получения растений-регенерантов Brassica oleracea L. in vitro 2021
  • Киракосян Рима Нориковна
  • Калашникова Елена Анатольевна
RU2759735C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОЛУКОВИЦ ТЮЛЬПАНОВ ИЗ ИЗОЛИРОВАННЫХ ЗАРОДЫШЕЙ В УСЛОВИЯХ IN VITRO 1996
  • Коломиец Т.М.
  • Мохно В.С.
RU2123256C1
Способ получения растений-регенерантов рода Brassica in vitro 2020
  • Киракосян Рима Нориковна
  • Калашникова Елена Анатольевна
RU2741647C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ИРИСА МЕЧЕВИДНОГО (I. ENSATA THUNB.) IN VITRO 2011
  • Тихомирова Людмила Ивановна
  • Смирнов Сергей Владимирович
  • Куцев Максим Геннадьевич
RU2481766C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДНЫХ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ИЗ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ BRASSICA OLERACEA L. IN VITRO 2015
  • Киракосян Рима Нориковна
  • Калашникова Елена Анатольевна
  • Соловьев Александр Александрович
RU2607007C1
Способ получения микрорастений лекарственного растения Stephania glabra (Roxb.) Miers 2021
  • Горпенченко Татьяна Юрьевна
  • Верещагина Юлия Витальевна
  • Чернодед Галина Кирилловна
RU2757318C1
СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ ХЛОПЧАТНИКА ИЗ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК (ВАРИАНТЫ) 1988
  • Тирумале Сриниваса Ранган
  • Дэвид Морис Андерсон
  • Канниах Раджасекаран
  • Джон Вилльям Грула
  • Ричард Лорн Хадспет
  • Ричард Ли Иенофски
RU2128428C1
Способ размножения растений сорго @ @ 1982
  • Эльконин Лев Александрович
  • Папазян Наталья Давидовна
  • Суханов Вячеслав Михайлович
  • Ишин Анатолий Григорьевич
  • Тырнов Валерий Степанович
SU1107799A1
Способ клонального микроразмножения растений сем. Betulaceae 2016
  • Ветчинникова Лидия Васильевна
  • Кузнецова Татьяна Юрьевна
RU2627194C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ РАПСА IN VITRO 2008
  • Муравлёв Анатолий Анатольевич
RU2374834C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 273 987 C2

Реферат патента 2006 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛНОЦЕННЫХ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ТЮЛЬПАНОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЕМ СЕМЯПОЧЕК IN VITRO

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к способу получения полноценных растений-регенератов тюльпанов культивированием семяпочек in vitro. Используют агаризованную половинную среду Мурасиге и Скуга, дополненную глицином, альфа-нафтилуксусной кислотой, антибиотиком ампициллином и 9%-ной или 3%-ной сахарозой (в зависимости от возраста семяпочек) для развития эмбрионов после изоляции от материнского растения семяпочек с частью завязи. Переносят разросшиеся семяпочки на свежую питательную среду сначала с тем же составом регуляторов роста и уменьшенным до 3% содержанием сахарозы, а затем на модифицированную среду Мурасиге и Скуга, содержащую 6% сахарозы, 6 БАП и НУК, при последовательной смене температурного и светового режимов. Заявленное изобретение обеспечивает сохранность гибридных эмбрионов на ранней стадии их развития, повышает жизнеспособность семинедельных гибридных зародышей, а также дает возможность сохранить оригинальные образцы генотипов от единичных эмбрионов. 5 ил., 5 табл.

Формула изобретения RU 2 273 987 C2

Способ получения полноценных растений-регенерантов тюльпанов культивированием семяпочек in vitro, заключающийся в том, что изолируют семяпочки с частью завязи через пять или семь недель после опыления, культивируют их в течение 16-17 недель в случае пятинедельных семяпочек и 4 недели - в случае семинедельных семяпочек при температуре +20°С на агаризованной половинной питательной среде Мурасиге и Скуга, дополненной глицином 2,0 мг/л, α-нафтилуксусной кислотой 1,0 мг/л, антибиотиком ампициллином 100 мг/л и 9%-ной сахарозой - в случае пятинедельных семяпочек или 3%-ной сахарозой - в случае семинедельных семяпочек, затем разросшиеся семяпочки переносят на свежую питательную среду с тем же составом регуляторов роста с 3%-ным содержанием сахарозы, культивируют их в темноте при температуре +5°С в течение 9-12 недель, снова переносят на модифицированную среду Мурасига и Скуга с 6%-ной сахарозой, содержащую регуляторы роста 6 БАП-3 мг/л, НУК-0,15 мг/л и продолжают культивировать при температуре +23-25°С, 16-часовом фотопериоде, освещенности 2-3 тыс. люкс до развития регенерантов высотой около 30 мм и образования дополнительных побегов.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2006 года RU2273987C2

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОЛУКОВИЦ ТЮЛЬПАНОВ ИЗ ИЗОЛИРОВАННЫХ ЗАРОДЫШЕЙ В УСЛОВИЯХ IN VITRO 1996
  • Коломиец Т.М.
  • Мохно В.С.
RU2123256C1
СПОСОБ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ 1994
  • Чережанова Л.В.
  • Овчинникова В.Н.
  • Мелик-Саркисов О.С.
RU2080780C1
СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ СМОРОДИНЫ IN VITRO 1991
  • Леонтьева-Орлова Л.А.
RU2039427C1

RU 2 273 987 C2

Авторы

Коломиец Татьяна Михайловна

Мохно Валентина Сергеевна

Даты

2006-04-20Публикация

2004-02-24Подача