Способ определения функциональной полноценности почечного аллотрансплантата Советский патент 1980 года по МПК A61B10/00 

1

Изобретение относится к области медицины и касается прогнозирования результатов трансплантации органов.

Известен способ определения функциональной полноценности почечного алло- трансплантата путем определения фермента в перфузате i.

Однако известный способ не позволяет определить полноценность аллотран- сплантатта до его пересадки. Целью изобретения является опредепе- Hate поаноценности аллотрансштайта га до его пересадки.

Эта цель достигается тем, что исследуют активность глицинамидинотрансферазы в первых 9,5-10,5 мл перфузата и при активности фермента 0,157-0,151 МБ трансплантат признают полноценным.

Для осуществления способа производят определение активности следующих ферментов: лактатдегидрогеназы (ЛДГ), аспартатаминетрансферазы (А-СТ),. глицин-амид инотрансферазы (ГАТ). .

Обычными методами активность ферментов в первых 10 мл гфомывного раствора, получаемых непосредственно сразу после периода первичной тепловой ишемии при отмывании донорской почки или вообще не выявляется или реакция идет не линейно, С целью концентрирования ферментов в указа1шь1е 1О мл промывного раствора добавляют сефадекс Г-25 1г на 10 мл. В этих условиях активность ферментов также не выявляется или реакция идет не линейно. Поэтому и про&одят различные модификации, к промывочному раствору добавляют следующие реактивы в растворах цнстеин в различных концентрациях (0,01 М; 0,05 М; 0,1 М); окисленный глутатион (0,О1 М; О,О5 М; 0,1 М)} 2-меркаптоэтанол (0,О1%; 0.05%; 0,1%); трилон Б (0,01 М; 0,05 М; ОД М).

Активность ферментов определяют при значениях рН 7,О; 7,2; 7,4; 7,6; 7,7; 8; 8,0- При определении активности ЛДГ используют различные буферы; гриЬ-буфер, натрий-натриевый фосфатный и калийнатри евый фосфатный буферы, а также реакцию проводят при температуре 25, 32 и 37 С. При опредепении акгивности ГАТ для выявления образовав- щихся микроколичесгв аргинина применяют коьщентрации красителя 0,01%; 0,02%; 0,03%; растворы 8-гидроксихинолина и О,1%, 0,2%, 0,3% растворы гипобро мита. , . , ., I.Оптимальными являются следуют ие варианты: для ЛДГ необходимо.концент рирование промывного раствора сефадек . сом , использование калий- атриевого фосфатного буфера с рН 7,4 при -32 С. Для ACT - концентрирование , сефадексом , использование трило- на Б. Для выявления активности ГАТ необходимо проводить инкубацию с буферно- :убстратной смесью, содержащей 0,О5% раствор 2.еркаптозтанола и 0,05 М раствор трилона Б при рН 7,7. Добавление к. буферной-субстратной смеси отдельно глутатиона, или цистеина, или тилона Б или их сочетаний (5 на риантов) не позволяет выявить.активност ГАТ в тех же 10 мл промывного раствора. , При выявлении оргинина лучшим соче танием являются 0,03%-ный раствор 8-гидроксйхинолина и р,3%-ный раствор гипобромита. Данные активности ферментов в промывном растворе, получаемом непосредственно сразу после периода первичной, тепловой ишемии при отмывании донорской почки, сопоставляют с функциональной активностью почки после ее пересадки реципиенту. Активность лактатдегидро геназы и аспартатаминотрансферазы независимо от того, когда наступала функция почки у реципиентов сразу на операционном столе(1), через 14-21 дней (11), или почв:а не функционировала (111), была приблизительно одинакова:

i

u

232138

255 ±57 О ±0,04в. O.1U ±Ор6

То есть активность этих ферментов не позволяет выявлять функциональную полноценность органа непосредственно после периода первичной теПловой ишемии.

Исследование айтивноети гяицин- амицинотрансферазы выявили бпрёдеЛеннуй) коррозшо между функциональной полноценностью органа и активностью фермента.

Как видно из таблицы, если актив.ность ГАТ в промывном растворе не превышала в среднем 0,,012 ME, функция почки у реципиента наступала на операционномстоле, если же активность ГАТ была 0,,061 ME, то функция у реципиента была на 14-21 день, если определяемого непосредственно после пе риода первичной тепловой ишемии при. заборе донорской почки. Если в первых 10 мл промьюного раствора, вытекающе- го из почечной вены при первичной перфузии консервирующим раствором непосредственно сразу после периода первичной тепловой ишемии, активность ГАТ была равна О - 0,ОЗМЕ (в среднем 0,01 . 0,012), аллотрансплантат у реципиента начинал функционировать на операционном столе; если активность в среднем составляла 0,15 74 0,О61 М Е, трансплантат функ.ционировал на 14-21 день;если же акгтиЁность ГАТ в среднем составляла 4:, ,104 ME, to трансплантат вообще не функционировал. В таблице представлена активность глицерин-амидинотрансферазы в перфу- зате непосредственно после периода первичной тепловой ишемии в сопоставлении с функцией пересаженной почки у реципиента. ПокаФункция у реципиента 5 74 же активность была 4,,104 ME, то почка не функционирована вообще. Таким образом, при активности ГАТ в промьшно растворе не превышающей 0,3 ME, трансплантат можно считать функционально полноценным, П р и м :е р . При первичной перфу зии во время забора почки у донора непосредственно после периода первичной тепловой ишемии из почечной вены собирают вытекающую жидкость в количест- ве 10 мл, прибавляют 1 г сефадекса Г-25 и центрифугируют на рефрижератор- ной центрифуге при 1400 Д и в течение 30 мин. Надосадочную жидкость отсасывают и вносят по 0,2 мл в 2 пробирки: опыт и контроль. В контроль для осаждения белков добавляют ОД мл 30%-ного раст вора трихлоруксусной кислоты. Затем в обе пробирки приливают по 0,7 мл буферно- :убстратной смеси, приготовленной на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,7 (содержащей растворы 0,007М орнитина 0,007М канаванина 0,О5% 2-меркаптоэтанола 0,05 М трилона Б), Обе пробирки инкубируют в течение, 1 ч при в термостате. Для осажде ния белков в опытные пробирки прибавля ют 0,1 мл 30% -ного раствора Трихлорук сусной кислоты. Все пробирки центрифугируют при 1400 д в течение 15 мин. Затем отсасывают 0,5 мл насадочной жидкости и юмещают в другие тробирки, прибавляют по 2,5 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,03%-ного 8 гидрокснхинолина и 1 мл 0,3%, раствора гипобромита, смешивают и фотометрируют при длине волны 490нм анализ против контроля на или на ФЗК-56М. Активность ГАТ выражают в международных единицак. При активности фермента в промывном растворе не превышающей 0,3 ME трансплантат сч(итают функционально полноценным. Предлагаемый способ позволяет достаточно прогнозирЬвать полноценность почечного амортрансплантата и избежать пересадки неполноценного органа. Формула изобретения Способ определения функциональной полноценности почечного аллотрансплан- , тата путем определения фермента в пер- фузате, отличающийся тем, что, с целью определения полноценности аллонтрансплантата до его пересадки, исследуют активность шишш-амидтютрансферазы в первых 9,5-10,5 мл перфузата и При активности фермента 0,,151 ME трансплантат призна-г ют полноценным. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе l.Uhoe.int , 1975, 30, р.362-368.