Способ определения стволовых лимфоидных клеток на гистологическом препарате Советский патент 1980 года по МПК G01N33/48 G01N3/38 

1

Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано дляустановления закономерностей .дифференцировки лимфоцитов, изучения механизмов их развития, возникновения лейкозов, иммунодефицитных состояний и разработки методов их лечения.

Известен способ определения стволовых ЛИМФОИДНЫХ клеток на гистологическом препарате путем фикс:ации в глютаровом сшьдегиде и четырехокиси осмия, заключения в смолы и электронно-микроскопического анализа 13 .

Однако известный способ не обеспечивает высокой точности. Целью изобретения является повышение точности способа.

Эта цель достигается тем, что ставят реакции на Т-антиген и ядерный хроматин в лимфоцитах и при наличии в ядре клеток только диффузного хроматина определяют принадлежность клеток к стволовым лимфоидным.

П р и м е РО Для работы используют 56 эмбрионов человека 7,5-8, 11-12 и 17-24 недель развития, полученных при медицинском аборте и преждевременных родах здоровых женщин. Под лупой выделяют тимус и разрезают

его пополам. Половину тимуса, иногда весь тимус или его часть фиксируют 2,5% глютаральдегидом на фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 4,5%

5 сахарозы.Другую часть тимуса или весь орган используют для приготовления клеточной суспензии. Кусочки тимуса, зафиксированные в глютаральдегиде в течение 1 ч при 0°С дополнительно фиксируют в 1% OS04 , обезвоживают и заключают в эпонаралдитную смесь. Срезы получают на ультратоме ЬКВ, контрастируют уранилацетатом и цитратом свинца и просматри15. вают в электронном микроскопе lEM 100В. Полутонкие срезы окрашивают толуидиновым синим и исследуют под световым микроскопом.

Суспензии клеток готовят путем

20 мягкого раздавливания ткани тимуса в стеклянном гоьюгенизаторе в охлажденной до среде 199 и процеживают через два слоя капроновой сетки. Большинство свободных клеток в

25 суспензии лимфоциты и 94-98% из

них - живые по тесту с трипановым синим. Лимфоциты с поверхностными рецепТорами к эритроцитам барана выявляются в реакции резеткообразова30 ния,. которую ставят по методу

jondal et al. Наличие Т-антигена на поверхности лимфоцитов определяют с помощью цитотоксического теста, который ставят по Komuro et Boyse. Для проведения реакции используют сыворотку против Т-лимфоцитов человека

Обнаружено, что лимфоидные клетки тимуса эмбрионов человека 7,58 нед развития практически не имеют рецепторов к эритроцитам барана, число розеткообразующих клеток не превышает 4% и в среднем составляет 1,37%. Антисыворотка не оказывает на эти лимфоциты цитотоксического действия во всех разведениях (см.таблицу ). При исследовании под световым и электронным микроскопом лимфоцитов тимуса эмбрионов человека 7,58 нед развития обнаружено, что 97-97,4% клеток характеризуются наличием только диффузного хроматина или зухроматина в ядрах и отсутствием участков гетерохроматина. Клетки имеют неправильной формы или округлые ядра с одним, двумя или тремя ядрьаиками. Электронноплотная цитоплазма этих клеток содержит небольшо число митохондрий и много свободных рибосом и полисом. Некоторые клетки имеют цитоплазматические отростки.

Лимфоидные клетки тимуса эмбрионо человека 11-12 нед развития характеризуются появлением на поверхности рецепторов к эритроцитам барана и Т-антигена. 79% клеток формируют розетки с эритроцитами барана и 60% клеток лизируются сывороткой против Т-лимфоцитов человека в разведении 1:10 (см.таблицу). При исследовании под световым и электронным микроскопом выявлено, что 91-95% лимфоцитов тимуса эмбрионов человека 11-12 нед развития содержит глыбки компактного хроматина или гетерохроматина в ядрах, которые видны вблизи ядерной мембраны или свободно располагаются в нуклеоплазк№. В некоторых клетках гетерохроматин в виде узкой полосы располагается у ядерной мембраны. Ядрышки уменьшаются в размерах, отростки исчезают, уменьшается количество свободных рибосом и полисом. Число лимфоидных клеток в тимусе эмбрионов человека 11-12 нед развития, имеющих рецепторы к эритроцитам барана и Т-антиген на поверхности и участки гетерохроматина в ядрах достоверно увеличено по сравнению с числом таких клеток в тимусе эмбрионов человека 7,5-8 нед развития (,01). .

У плодов 17-24 нед развития 98,5% лимфоцитов тимуса содержат компактный хроматин в ядрах, который занимает большую часть ядра и образует в них сложный причудливый рисунок. Узкий ободок электронно плотной цитоплазмы этих клеток содержит небольшое число митохондрий и полисом. 78% лимфоцитов тимуса имеют рецепторы к эритроцитам барана и 71/5% клеток лизируются антисывороткой в разведении 1:10 (см.таблицу). Число клеток, имеющих поверхностные рецепторы к эритроцитам барана и компактный хроматин в ядрах, в тимусе плодов неловека 17-24 нед развития достоверно увеличено по сравнению с их числом в тимусе эмбрионов человека 7°,5-8 над развития (,001 и достоверно не отличается от их числа в тимусе эмбрионов человека 1112 нед развития (,05),.

Процентное содержание лимфоцитов в тимусе эмбрионов человека разных сроков развития, характеризующихся наличием диффузного или компактного хроматина в ядрах и антигенов дифференцировки - Т-антигена и рецептйров к эритроцитам барана.

Использование предлагаемоного споба позволяет определить стволовые лимфоидные клетки СЛК точно, а не предположительно, в отличие от известного способа. Это открывает возможность более детальной характеристики популяции лимфоидных клеток при заболеваниях крови, в том числе и злокачественных, что важно при выборе метода лечения и оценки его результатов. Определение с помощью предлагаемого способа истинного числа СЛК в клеточных суспензиях обеспечит более правильный подбор донорской ткани для лечения.иммунодефицитных.состояний разной этиологии.

Продолжение таблицы

Формула изобретения

Способ определения стволовых лимфоидных клеток на гистологическом препарате путем фиксации в глютаровом альдегиде и четырехокиси осмия, заключения в смолы и электронно-микроскопического анализа, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, ставят реакции на Т-антиген и ядерный хроматин в лимфоцитах и при наличии в ядре

клеток только диффузного хрюматина определяют принадлежность клеток к стволовым яимфоидным.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Каведкий Р.Б.Бутенко З.А., Зак К.П. и Клочко Э.В. О возможности распознавания гёмопоэтическихч стволовых клеток методом электронной микроскопии, ДАН СССР, 1974, т. 217, 1, с,207-209.