СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК С РЕЦЕПТОРАМИ К БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМ ВЕЩЕСТВАМ И ИХ ПОПУЛЯЦИОННОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к патологической физиологии, иммунологии, аллергологии, и может быть использовано для изучения и комплексной оценки на клеточном уровне модулирующих свойств биологически активных веществ (нейромедиаторов, гормонов, иммуномодуляторов, ксенобиотиков с нейротропным компонентом биологической активности), их роли в регуляции иммунного статуса макроорганизма при различных его состояниях, в том числе в оценке реактогенности и иммунобиологической активности вакцинирующих препаратов, а также адаптационно-компенсаторных возможностей нервной и иммунной систем организма в условиях неблагоприятного воздействия факторов окружающей и производственной среды.

Существуют различные методы выявления клеток с рецепторами для медиаторов, которые могут быть объединены в две группы. Первая группа методом основана на взаимодействии радиоактивной метки с соответствующими клеточными рецепторами. Реализация их экологически небезопасна и требует дорогостоящих реагентов и оборудования. Кроме того, для установления популяционной принадлежности лимфоидных клеток с рецепторами для биологически активных веществ необходимо включение дополнительных этапов получения различными препаративными методами популяций T и B-лимфоцитов, что приводит к увеличению трудоемкости способа, а также затрачиваемого времени на получение конечных результатов.

В основе методов второй группы положен принцип взаимодействия рецептора на поверхности клетки с соответствующим биологически активным веществом, конъюгированным с различными частицами (сефарозой, стеклянными бусинами, красными клетками крови) (4).

Известен способ определения лейкоцитов периферической крови человека с рецепторами для гистамина, основанный на их способности соединяться с эритроцитами быка, обработанных формалином и нагруженных конъюгатом гистамина с кроличьим сывороточным альбумином (3). Недостатком данного способа является невозможность одновременного определения в полученной взвеси гистаминрецептирующих клеток и установления их популяционной принадлежности с помощью широко применяемых эритроцитарных маркеров T и B-лимфоцитов в тесте двойного розеткообразования. Необходимость использования высокоочищенных дорогостоящих препаратов, а также небольшой срок хранения конъюгата (не более 2 мес при -20^oC) значительно снижает доступность и широту его применения в обследовательской работе.

Наиболее близким техническим решением является способ определения лимфоидных клеток с рецепторами для гистамина, серотонина, катехоламинов в крови и органах крыс, мышей по розеткообразованию с эритроцитами барана, нагруженных соответствующими медиаторами (1). При этом сенсибилизация эритроцитов происходит одномоментно с их фиксацией 2,5% раствором глютарового альдегида в течение 1 ч. Данный способ получения сенсибилизированных эритроцитов не предусматривает их длительное хранение. Вследствие этого проведение новых циклов исследований в различные сезоны года, возобновление их после длительного перерыва требует приготовление новых серий сенсибилизированных эритроцитов, что отрицательно влияет на стандартизацию способа, его точность и воспроизводимость результатов. Применяя данный способ, невозможно провести одновременно индикацию лимфоидных клеток с рецепторами для соответствующих медиаторов и определение их популяционной принадлежности, так как эритроциты барабана используются для идентификации T-лимфоцитов человека в тесте спонтанного розеткообразования (E-POK), а также для определения B-клеток у некоторых видов лабораторных животных в тесте EAC-розеткообразования.

Предлагаемый способ повышает точность определения, информативность и достоверность результатов, легко воспроизводим, универсален и позволяет исключить этап получения T и B-лимфоцитов различными методами, что снижает его трудоемкость, затраты дорогостоящих реактивов и оборудования, сокращает время, необходимо для получения конечных результатов.

Способ осуществляется следующим образом. Рецепторы к биологически активным веществам (гистамину, серотонину, аденозину и др.) на поверхности клеток крови и органов различных видов лабораторных животных (морских свинок, кроликов, мышей и др.), человека выявляют с помощью фиксированных и сенсибилизированных соответствующими биологически активными веществами куриных эритроцитов, морфологически отличающихся как от иммунокомпетентных клеток различных видов животных, так и от всех применяемых в настоящее время эритроцитарных маркеров популяций лимфоцитов (эритроцитов барабана, быка, кролика, мыши, обезьяны). По взаимодействию сенсибилизированных эритроцитов с клетками устанавливают наличие на последних гомологичных рецепторов, а по взаимодействию лимфоцитов с сенсибилизированными биологически активными веществами куриными эритроцитами и соответствующими эритроцитарными маркерами популяций выявляют рецепторы к биологически активным веществам на поверхности клеток и определяют принадлежность их к T и B-лимфоцитам.

Взятие крови. Кровь в количестве 2 3 мл забирают в стерильную пробирку (емкостью 20 мл) с предварительно внесенными 2-3 каплями гепарина (концентрация 3000 5000 ед/мл) любым способом в зависимости от конкретного исследования (из сердца у морских свинок, из сердца или краевой вены уха у кроликов, декапитацией у белых и линейных мышей, из локтевой вены у человека), осторожно перемешивают. Добавляют среду 199 или стерильный забуференный физиологический раствор pH 7,2 в соотношении 2:1 (среда кровь).

Приготовление градиента плотности. В качестве градиента плотности используют раствор фиколл-верографина плотностью 1,077 г/куб.см. Рабочий раствор готовят, смешивая 24 ч. 9% раствора фиколла и 10 ч. 34% раствора верографина (уротраста, изопака, гипака). Оптимальную плотность для выделения лимфоцитов 1,077 1,078 г/куб.см контролируют с помощью денситометра. Пример расчета: при наличии 76% раствора верографина (1 ампула содержит 20 мл)
в 100 мл 76 г X 15,2 г.

в 20 мл X г,
Из расчета на 34% раствор верографина:
в 100 мл 34 г
в X мл 15,2 г X 44,7 мл.

Таким образом, для получения 44,7 мл 34% раствора верографина к 20 мл имеющегося 76% раствора верографина необходимо добавить 24,7 мл дистиллированной воды.

Расчет приготовления раствора фиколла:
на 10 ч. верографина 24 ч. 9% раствора фиколла
на 44,7 ч. верографина X ч. 9% раствора фиколла.

Расчет навески фиколла:
в 100 мл 9% раствора 9 г
107,3 мл 9% раствора X г X 9,66 г.

Общий объем фиколл-верографина: 44,7 + 107,3 152 мл. Раствор стерилизуют фильтрованием через мембранный фильтр с размером пор 0,23 мкм.

Выделение лимфоцитов из крови. В химически чистые пробирки емкостью 20 мл и внутренним диаметром 12 14 мм наливают 3 4 мл градиента плотности. Затем в пастеровскую пипетку набирают разведенную кровь и осторожно по стенке, удерживая пробирку в наклонном положении под углом 45^o, наслаивают кровь на градиент плотности, не допуская смешивания слоев. Соотношение объемов 2:1. Пробирки центрифугируют при 20 мин при 420g. В результате лимфоциты образуют беловатое кольцо над слоем градиента плотности. Над лимфоцитами находится диффузный мутный слой тромбоцитов, а еще выше прозрачная плазма. На дне пробирки собирают эритроциты и гранулоциты. В слое расположенного над ними градиента плотности находятся в виде легкого помутнения агрегаты гранулоцитов с тромбоцитами и лимфоцитами. Пастеровской пипеткой с тонко оттянутым капилляром и соединенной с резиновой грушей или шприцем отсасывают слой лимфоцитов. При выполнении данной процедуры необходимо соблюдать максимальную осторожность, чтобы не вызвать перемешивания слоев. Полученная взвесь содержит примесь градиента плотности и тромбоцитов, которую необходимо удалить путем отмывания клеток. Для этого полученную суспензию лимфоцитов смешивают в соотношении 1: 2 со средой 199 без гепарина или раствором Хенкса без ионов кальция и магния, охлажденными до +4^oC, и центрифугируют 10 мин при 1500 об. /мин. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в этой же среде. Процедуру повторяют 2-3 раза. По завершении процесса отмывания клеток осадок ресуспендируют в среде 199 или Игла, доводя концентрацию клеток до 5•10⁶ в 1 мл.

Выделение лимфоцитов из органов. Лимфоидные органы (тимус, лимфатические узлы, селезенку) животных освобождают от прилежащих тканей, капсулы, измельчают в охлажденном до +4^oC раствора Хенкса без ионов кальция и магния, продавливают через стальное сито с диаметром пор 1 мм. Полученную суспензию фильтруют через нейлоновый фильтр. Клетки осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 7 мин, а затем дважды отмывают в этом же растворе аналогично лимфоцитам крови, после чего ресуспендируют в среде 199, доводят концентрацию до 5•10⁶ клеток на 1 мл.

Выделение перитональных макрофагов. Животных забивают способом в зависимости от вида биомодели (мышей декапитацией или дислокацией шейного отдела позвоночника; морских свинок декапитацией или хлороформированием; кроликов хлороформированием), затем фиксируют на спине. Делают разрез по средней линии передней брюшной стенки и осторожно отсепаровывают кожный лоскут, не нарушая целостности брюшины. Через прокол иглой, соединенной со шприцем, в брюшную полость вводят среду 199 или среду Игла с гепарином (5 ед. на 1 мл среды) в объеме 3 мл для мышей, 15 мл для морских свинок, 100 мл для кроликов. Осторожно массируют переднюю брюшную стенку. Через 5 7 мин в брюшине пастеровской пипеткой, соединенной с резиновой грушей, собирают, стараясь не повредить внутренние органы и петли кишечника, содержимое, сливают через нейлоновый фильтр на пластиковые чашки Петри диаметром 9 14 см и инкубируют в течение 1 часа при 37^oC в избытке CO₂. Инструменты, пастеровские пипетки, шприцы, чашки Петри используют стерильные. По истечении срока инкубации среду с неприлипшими клетками удаляют. Прилипшие к пластику клетки дважды отмывают стерильным забуференным физиологическим раствором pH 7,2. Для получения взвеси прилипших к пластику клеток в чашку добавляют 1,5 ±0,5 мл среды 199 и осторожно резиновым шпателем снимают прилипшие клетки. Полученную взвесь пипетируют несколько раз до исчезновения крупных агрегатов и переносят в охлажденную круглодонную пробирку. Определение жизнеспособности клеток проводится общепринятыми методами по отношению к красителям зозину БА или трипановому синему. Жизнеспособность клеток в тесте с трипановым синим при данном способе выделения составляет 94 96% Выход макрофагов контролируется в мазках окрашиванием по Романовскому Гимза и составляет не менее 95%
Выделение альвеолярных макрофагов. Из грудной полости целиком отпрепаровывается сердечно-легочный комплекс и отмывается от крови в стерильном физиологическом растворе pH 7,2. Посредством канюли через трахею вводят среду 199 с гепарином (5 ед. на мл среды) в количестве 15 мл для морских свинок, 25 30 мл для кроликов. Содержимое отсасывают шприцом объемом 20 мл, сливают через нейлоновый фильтр на пластиковые чашки Петри диаметром 9 14 см и инкубируют в течение часа при 37^oC в избытке CO₂. В дальнейшем получение взвеси прилипших к пластику клеток проводят как при выделении перитонеальных макрофагов.

Фиксация и сенсибилизация эритроцитов. Куриные эритроциты дважды отмывают стерильным забуференным физиологическим раствором pH 7,2 и суспендируют до 0,5% концентрации. Для удаления образовавшихся агрегатов взвесь фильтруют с соблюдением стерильности через 4 слоя марли. Фиксацию эритроцитов проводят в течение 20 мин при 37^oC 2,5% раствором глютарового альдегида в стерильном фосфатно-солевом буфере pH 7,2, который добавляют к 0,5% взвеси куриных эритроцитов в соотношении 1:1 до конечной концентрации 1,25% Фиксированные эритроциты осаждают центрифугированием при 400g, супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют до 5% концентрации в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе pH 7,2. Полученная взвесь фиксированных куриных эритроцитов может храниться при 4^oC в течение 2 лет и расходоваться по мере необходимости для приготовления сенсибилизированных эритроцитов. Для этого 5% взвесь фиксированных куриных эритроцитов обрабатывают растворами соответствующих биологически активных веществ (гистамина, серотонина, катехоламинов, аденозина и др. ) в стерильном фосфатно-солевом буфере pH 7,2 концентрацией 100 мкг/мл в соотношении 1:1 в течение 1 ч при 37^oC. Кортикостероиды предварительно растворяют в нескольких каплях абсолютного метанола, а затем разводят фосфатно-солевым буфером pH 7,2 до указанной концентрации. Сенсибилизированные эритроциты осаждают центрифугированием при 200g в течение 15 мин и после удаления надосадочной жидкости ресуспендируют до 5% концентрации в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе pH 7,2. Срок хранения при 4^oC сенсибилизированных куриных эритроцитов составляет 1 год без изменения их свойств. Перед определением взвесь разводят в 8 раз фосфатносолевым буферным раствором pH 7,2. Рабочая взвесь сенсибилизированных куриных эритроцитов имеет концентрацию 0,6%
Определение рецепторов к биологически активным веществам 0,5 мл клеточной суспензии с концентрацией 5•10⁶ клеток в 1 мл помещают в круглодонную пробирку вместимостью 10 или 20 мл по ГОСТ 25336-82E и прибавляют 0,5 мл 0,6% рабочей взвеси сенсибилизированных соответствующим биологически активным веществом куриных эритроцитов, хорошо смешивают и оставляют на 18 ч при 4^oC. Подсчет розеткообразующих клеток (POK) и определение их жизнеспособности проводят в камере Горяева. Для этого 0,1 мл осадка смешивают с 0,1 мл 0,2% раствора эозина БА на фосфатно-солевом буфере pH 7,2, затем вносят в счетную камеру Горяева. Для подсчета используют микроскоп БИОЛАМ P14, увеличение 150 (окуляр K 5^x, увеличение объектива x 20, увеличение насадки бинокулярной AY 12 x 1,5), с осветителем ОИ-35. Подсчитывают число POK среди 300 400 ядросодержащих клеток и определяют их процентное содержание по формуле:

A количество розеткообразующих клеток во всех больших квадратах,
В общее количество ядросодержащих клеток во всех больших квадратах.

Розеткообразующими считают клетки с 3 и более прилипшими к их поверхности эритроцитами.

Определение популяционной принадлежности лимфоидных клеток с рецепторами для биологически активных веществ. Для определения принадлежности к Т-клеткам в пробирки последовательно вносят 0,3 мл лимфоцитов в концентрации 5•10⁶ клеток в 1 мл, 0,3 мл рабочей взвеси сенсибилизированных соответствующим биологически активным веществом куриных эритроцитов и 0,3 мл эритроцитарного маркера Т-клеток в зависимости от биологического вида используемой экспериментальной модели. Пробирки с содержимым осторожно перемешивают встряхиванием и помещают в термостат при температуре 37^oC на 15 мин, а затем в холодильник при температуре 4 6^oC на 18 ч. Подсчет двойных розеткообразующих клеток и определение жизнеспособности проводят с раствором красителя зозина БА в камере Горяева, как описано выше. К двойным розеткообразующим лимфоцитам причисляются клетки с прикрепившимися к ним не менее чем 2-мя куриными сенсибилизированными эритроцитами и 2-мя маркерными эритроцитами. Для определения принадлежности к В-клеткам в пробирки последовательно вносят 0,3 мл взвеси лимфоцитов в концентрации 5•10⁶ клеток в 1 мл 0,3 мл рабочей взвеси сенсибилизированных соответствующими биологически активными веществами куриных эритроцитов и 0,3 мл эритроцитарного маркера В-клеток (EAC-розеткообразование) в зависимости от экспериментальных животных. Пробирки с содержимым осторожно перемешивают встряхиванием и помещают при температуре 37^oC на 30 мин, а затем в холодильник при температуре 4 6^oC на 18 ч. Подсчет двойных розеткообразующих клеток и определение их жизнеспособности проводят с раствором красителя зозина БА в камере Горяева как описано выше.

Пример 1. Определение количественных характеристик распределения гистаминрецептирующих клеток у мышей различных линий.

В опыт были взяты по одной группе мышей массой тела 18 20 г в количестве 10 особей каждая линия CBA (H-2^k, C57BL/6 (H-2^b, NFS/n (чувствительных к экзогенному гистамину), NFR/n (резистентной к гистамину), лабораторные белые мыши. Выделение лимфоидных клеток из крови и органов, перитонеальных макрофагов и определение процента гистаминрецептирующих клеток проводили по описанной выше схеме. При наличии гомологичных рецепторов для биологически активных веществ к поверхности клетки прилипают 3 или более сенсибилизированных БАВ куриных эритроцитов, формируя так называемую розетку. Результаты распределения гистаминрецептирующих клеток у мышей различных линий представлены в табл. 1. Из табл.1 следует, что имеются межлинейные различия количественных характеристик пула клеток с рецепторами для гистамина.

Пример 2. Изменения нейромедиатором ацетилхолином количественных характеристик пула аденозинрецептирующих клеток у морских свинок в условиях вакцинации против туляремии.

В опыт были взяты 3 группы морских свинок обоего пола массой тела 180 - 200 г по 5 особей в каждой. 1 группу морских свинок иммунизировали отраслевым стандартным образцом коммерческой живой туляремийной вакцины производства Омского научно-исследовательского института природноочаговых инфекций накожным методом в дозе 2•10⁸ м.т. (1 человеко-доза). 2-ой группе экспериментальных животных за 10 мин до вакцинации вводили подкожно нейромедиатор ацетилхолин в дозе 250 мкг. В 3-ей группе были интактные животные. Выделение лимфоидных клеток из крови и органов, перитонеальных макрофагов и определение аденозинрецептирующих клеток проводили по схеме, описанной выше. Аденозинрецептирующие клетки определяли через 1 сут с момента вакцинации. Результаты представлены в табл. 2. Из табл.2 следует, что нейромедиатор ацетилхолин индуцирует 6 8-кратное увеличение аденозинрецептирующих клеток в крови и тимусе и уменьшение в 1,7 раза процента макрофагов с рецепторами для аденозина по сравнению с количеством данных клеток у морских свинок, вакцинированной одной туляремийной вакциной.

Пример 3. При взаимодействии биологически активных веществ, конъюгированных с фиксированными куриными эритроцитами, с гомологичными поверхностными рецепторами структурами клетки образуются агрегаты, состоящие из клеток и сенсибилизированных эритроцитов. На фиг. 1 представлен данный агрегат. В центре малый лимфоцит, выделенный из тимуса мышей линии C57 BL/6, с прилипшими к его поверхности сенсибилизированными гистамином куриными эритроцитами. Фиг.2 иллюстрирует образование агрегатов (так называемых розеток) лимфоцитами, выделенными из селезенки иммунизированных вакцинным штаммом чумного микроба EB линии НИИЭГ морских свинок, с эритроцитами, сенсибилизированными серотонином.

Пример 4. Определение принадлежности в B-клеткам лимфоцитов с рецепторами для серотонина, выделенных из селезенки морских свинок, иммунизированных вакцинным штаммом чумного микроба EB линии НИИЭГ. Группе морских свинок (8 особей в группе) вводили однократно подкожно в объеме 0,5 мл 5000 микробных клеток двухсуточной агаровой культуры вакцинного штамма чумного микроба EB линии НИИЭГ. Через 24 ч животных забивали хлороформированием. Выделение лимфоидных клеток и определение их принадлежности к B-клеткам проводили по схеме, описанной выше. На фиг. 3 зафиксирован агрегат, так называемая "двойная розетка", образованный лимфоцитом с прилипшими к его поверхности эритроцитами барана, сенсибилизированными кроличьей антиэритроцитарной сывороткой первичного иммунного ответа в субагглютинирующем разведении с C₃-компонентом комплемента, и куриными эритроцитами, конъюгированными с серотонином. Все это позволяет заключить, что данный лимфоцит является B-лимфоцитом и несет на своей поверхности рецепторы к серотонину.

Использование: медицина, патологическая физиология, иммунология и аллергология, нейроиммунолония и может быть использовано для одновременного определения клеток с рецепторами для биологически активных веществ и их популяционной принадлежности. Сущность изобретения: рецепторы к биологически активным веществам (нейромедиаторы, гормоны и др.) на поверхности клеток всех видов лабораторных животных, человека выявляют с помощью морфологически отличающихся куриных эритроцитов, фиксированных 1,25% глютаровым альдегидом в течение 20 мин и сенсибилизированных соответствующим биологически активным веществом. По взаимодействию сенсибилизированной метки с поверхностью клеток определяют наличие на последних гомологичных рецепторов, а по одновременному взаимодействию лимфоцитов с меткой и соответствующими эритроцитарными маркерами популяций выявляют клетки с рецепторами для биологически активных веществ и определяют принадлежность этих клеток к T и B-лимфоцитам. Цель изобретения - повышение точности и информативности способа, универсальность, определение популяционной принадлежности лимфоидных клеток одновременно с выявлением рецепторов для биологически активных веществ. 3 ил.

Способ одновременного определения клеток с рецепторами к биологически активным веществам и их популяционной принадлежности путем розеткообразования, отличающийся тем, что в качестве эритроцитарной метки используют 0,5% взвесь куриных эритроцитов, фиксированных 1,25% глютаровым альдегидом в течение 20 мин и сенсибилизированных соответствующим биологически активным веществом (гистамином, серотонином, адреналином, аденозином, кортикостероидами и др. ) концентрацией 100 мг в 1 мл фосфатно-солевого буферного раствора рН 7,2 и по взаимодействию сенсибилизированной метки с поверхностью клеток определяют наличие на последних соответствующих рецепторов, а по одновременному взаимодействию лимфоцитов с меткой и соответствующими эритроцитарными маркерами популяций выявляют клетки с рецепторами к биологически активным веществам и определяют принадлежность этих клеток к Т и В лимфоцитам.