Штамм культивируемых клеток PapIo намаDRYаS - продуцент лимфотропного герпесвируса павианов и ретровируса типа С из семейства STLV-1 Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 

антибиотиков: 100 Ед./мл пенициллина и 1OQ мкг/мл стрептомицина Через 21 день культивирования среда куль™ тивнрования стала активно метаболи- зироваться без признаков прикрепле- ния к твердому субстрату. ,

Таким образом, сформированная суспензионная культура клеток ВГОЫ1 стабильно сохраняет свои ростовые

потенции и биологическую характеристику.

Штамм хранится в Специализирован- ной коллекции соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции кле- точных культур под номером ВСКК(П)- 292D0

Морфологическая характеристика и культуральные свойства.

Постоянная клеточная культура

В1Ш-П является суспензионной, клетки которой пролиферируют в жидкой среде без признаков прикрепления к твердому субстрату. Культура представлена лимфоидными клетками, по морфологи- ческой характеристике напоминающими лимфобласты. Осноаная масса клеток - это крупные клетки с большим выраженным ядром и узким ободком цито- аиазмы. Крупное ядро имеет нуклеолы, одну крупную иди две поменьше, окра шивающиеся в нежно-голубой цвет при окраске препарата по Романовскому- Гимза. Наряду с крупными клетками встречались и клетки меньших размеров., содержащие ядро с нуклеонами. 3 культуре встречались и макрофаги, составляющие 1-2% всей клеточной популяции.

Время удвоения клеточной массы линии ВПЛ-ГТ.-составляет 48 ч. Посевная доза 4 - 5x1 Qff кл./мл. На 5-6-й день культивирования культура достигает максимальной клеточной плотности,, составляющей 7,5-8,0x10 кл./мл Клетки культуры можно адаптировать к условиям культивирования в менее обогащенной среде. Так9 первичная культура культивировалась на среде с 15% эмбриональной сыворотки коров, затем стабильную линию удалось адаптиро- вать к условиям содержания в пита- тельной среде с 8% эмбриональной сы- выротки. Затем культура была адаптирована к среде, в которой 8% эмбриональной сыворотки были заменены на (5% сыворотки крупного рогатого скота отечественного производства. При этом число мертвых клеток на среде

,

5

0

0

5

594

с эмбриональной сывороткой составляло 8-10%, а на среде с отечественной бычьей сывороткой было лишь немногим больше, т.е. 15-20%.

Клетки культуры хорошо перекосят криоконсервацию. В качестве криопро- тектора используется питательная смесь с 8% диметилсульфоксида.

Цитогенетическая характеристика, Цитогенетический анализ 50 метафаз линии ВГШ-11 выявил наличие карио- типически различных два клона: 30 - с нормальным хариотипом - 42,XX; 20 - с патологическим - 42,, 20, Щ, М2,

Иммунологическая характеристика клеток. Клетки штамма ВПЛ-П не образуют Е-розетки с эритроцитами барана, экспрессируют поверхностные и vитоплазматические иммуноглобулины Mfl,, Небольшой процент клеток содержит рецепторы к комплементу. Моно- клональный В-клаточный фенотип клеток штамма подтвержден в исследованиях с моноклональными антителами (Мон AT). Результаты исследо- ваний представлены в таблице.

В отличие от ВШ1-ТХ клетки известного штамма 594S-Fg не экспрессируют поверхностные ч цитоплазматические иммуноглобулины, не имеют рецепторов к комплементу. Клетки известного штамма реагируют с Мон AT OKT, выявляющими Т клетки с рецепторами к эритроцитам барана и практически не содержат общего В-клеточного антигена (iFg).

Электронно-микроскопическая характеристика., На ультратонких срезах клеток штамма ВПЛ-П при анализе в электронном микроскопе SEM ЮОв при инструментальном увеличении от 5000 до 50000 были обнаружены вирусные частицы, имеющие морфологическую характеристику ретровирусов типа С. Вирусная популяция характеризовалась выраженным полиморфизмом. Размеры частиц колебались в пределах от 60-70 до 250-400 нм. Размеры нуклеотада, имеющего округлую форму, полигональную или конусовидную форму, составляли от 30 до 250 км. Вирусные частицы локализовались в цистернах цитоплазмы или внеклеточно, Наблюдались массивные скопления ви- , русных частиц. Вирус, обнаруживаемый -в клетках штамма ВПЛ-II, имел структурное сходство с вирусами группы

51

HTLV-1. Б 0S5% клеток штамма о&нарт4живахшсь также вирусные частицы с морфологической структурой вируса герпеса. Вирусная популяция, состоя- щая из незрелых и зрелых вирусных частиц, располагалась в ядре, цитоплазме , а зрелые частицы - в межклеточном пространстве

Трансформирующая активность. Тран формирующая активность была изучена на лимфоцитах павианов гамацрнлов (возраст животных 6-8 мес) и лимфоцитах крови пупочного канатика человека. Культуральная жидкость штамма ЕШ1-Т1, взятая на 7-и день К ШЬТНБИ- рования без смены среды при 3/°С фильтрованная для освобождения от л ток и их обломков через мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм, в титре 10 ТД(50) 0,5 мл, вызывала лт.-1 фобластоидную трансформацию лимфоги- тов периферической крови павианов через 20-25 дней после кнЈиии4-- вачия Что касается лимфоцитов крови пупочного канатика человека, то трансформирующая активность вирусов дгт указанных клется: выявлена не была в ченис гюлее месчда паилюденш,Огкогенные сгойс за. Онкоген. остъ вируса (0В), реплшшручнг.-кся в куаь- туре ВГШ-П, изучалась на беспородных кроликахо Кулътуральная жяцхость на 6-7-й день культивирования без смены питательной среды была фильтрована через мембранные фильтры с оаз. мерок пор 0,&5 мкм для освобождения от клеток и их обломков, Бесклеточный материал в объеме i0 мл был введен 2-3-месячным кроликам внутримышечно. Через 20-25 дней на месте введения пальпировалось округлое образование, имеющее тенденцию к росту Через 35-36 дней у кроликов, зз&итых эфиром в предагональном состою нии 5 за- ределялась следующая картина: опухоль размером 2x3 см на месте вьсце- ния, метастазы в легкие, тимус, значительное увеличение паратрахеальных лимфотических узлов и умеренное паховых,, увеличение селезенки, достигающей 5 г (в номере у кроликов этого возраста вес селезенки составлял около 1,0 г). В брюшной полости определялся геморрагический асциг. Гистологически: на гистологических срезах, окрашенных гематоксилиэозином взятых из первичной опухоли, а также легких, почки, селезенки и паратра

25

01

,

jp ,5 2Г

0

5

0

5

0

5

596

реальных пимфатг1 р«. ох злол, обнаружены структуры л-аОКс11 есп енной лимфомы с явлением генерализации с вовлечением з про; лес всех керечис- легных органов.

Молекулярьо-бч- то,- веская ь биохимическая харагтеригтти а.

Определение у характеристика ГВП и TLV-i посг дова-епт .тостей в клетках ВПЛ--П проводилось с помощью метода молекупярной гбок Днза. Ч Ч по Саузерпу с иепекозовс..чу берментов растпикцга, Pst h cnR1. l клетках указанного lu raMM,- ьш обнаружен интс- гриооват .ы; про. smyc o гроьчруса тъ- па С, оЬьзьсг % . Рвчоюрые отличия по с ам рестрикции от ретро- вируса типа С чро:овела . Рест- рикгивные чарты ГВП, репродуцпрующе- 4гося в клетках ВГШ-, аналогичны вирусу г:мамма 594S-Fg.

3 ультрр.ценгсьфу-ате культуральной жидкости штамма ВШ1-11 обкг-оуэкена ревертазз, эктппно траьср тбируи щая синетнческую матрицу поли(рА)олиго (дТ) в присутствии угонов , что хапактетлО для обратной транс- криптазь. онковчг-i сов группа HTLV-1.

fflтs м иь.уусл.эо уцнрзяотцг.а клеточ- ьой лиииг ВЕЛ -II со:фал°ет неизменны- ни свои сиологич скга характеристики на протяаек:111 17 пассажей кепрерыв- ю го к льгиьирр снш.. -з также ре куль- ивирования -.селе аг-оч ш-шания на протяжении 9 лет.

Пример. Клетки кл амма БПЛ- II в коJTII че с тв е х 1 0 лл. /мл лпгательной смеси, состг щей из 92% среды РРМПб О s сочетании г 8л эмбриональной сыворотки сорсв, 300 мкг/мп глю амика и антибиоти- KOiiiiOO Ед./j.n пеници п га А 00 мкг/нл стрет -м щьна, помещали во флаконы емкостью 300 мл в количестве 50 мл. Культивировали 6 дней без смены среды в термостате при 37 С. На 7-й день к льпгъировакия клетки отделяли центрифугированием (1000 об/мин за 10 мин при 4°С), а надосадок, пр дс аьляюций вируссо- держащую хулх гувальную жидкость, фильтровал: черео мембранные фильтры фирмь Ниллипор с размером пор 0,45 мкм для удаления клеток и клеточных обломков. Фильтровальная куль- туральная жидкост представляла вирусный материал, который пводили беспородньм т ролика з возрасте 2-

3 месяца в количестве 10 мл внутримышечно Через 20-25 дней на месте введения материала обнаруживали не- .большое подвижное образование с четкими контурами, плотное, размером 1x2 см в среднем, а также небольшое увеличение периферических лимфатических узлов. Через 35-36 дней у кроликов наблюдалась генерализованная-лимфома: опухоль на месте введения размером 2x3 см и больше, значительное увеличение селезенки, метастазы в легкие, тимус, лимфатические узлы, подкожные кровоизлияния,

П р и м е р 2. Клетки штамма ВШ1- П в количестве 4x10 кп/мл в питательной смеси, аналогичной примеру 1, за исключением сыворотки (дорогостоящую импортную 8%-ную бычью эмбриональную сыворотку заменили на 15%-ную легкодоступную бычью сыворотку отечественного производства), засевали и культивировали по примеру 1. Куль- туральную жидкость собирали обрабаты- вали и вводили кроликам аналогично примеру 1. Через 45 дней наблюдения у кроликов отмечались опухоли на месте введения, увеличение лимфатических узлов и спЛеномегалия,

Индуцированные онкогенными вирусами павианов (ГВП и ретровирусом тлпа С) опухоли кроликов являются доказательством онкогенной активности ассоциации двух типов лимфотройных

0

5

онковирусов приматов и служат лабораторной моделью вирусиндуцирован - ных злокачественных лимфом- человека, поскольку онковирусы, реплицирующиеся в предлагаемом штамме, являются аналогами онковирусов человека: ГВП аналог вируса Эпштейн-Барр, а ретровирус- типа С павианов STLV-1 аналог HTLV-1.

Таким образом, с помощью предлагаемого штамма можно закономерно воспроизводить вирусиндуцированный опухолевый процесс у кроликов, аналогичный таковому у человека, на котором возможно изучать этиологию, патогенез, вакционопрофилактику и противоопухолевую активность различных химиопрепаратов. Полученная модель служит также объектом для изучения и разработки методов ранней диагностики опухолевых заболеваний. Кроме того, культивирование штамма возможно с применением бычьей сыворотки отечественного производства с сохранением биологической активности его, что значительно удешевляет его использование.

0

5

30 Формула изобретения

Штамм культивируемых клеток Papio hamadryas ВСКК(П)-292Е - продуцент лимо тро пно го ге рпе ев иру са пав ианов и ретровируса типа С из семейства STLV-1.

I