СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОТТОРЖЕНИЯ ПОЧЕЧНОГО АЛЛОТРАНСПЛАНТАТА Российский патент 2009 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к трансплантологии, и может быть применено преимущественно при остром отторжении почечного аллотрансплантата.

Трансплантация почки на сегодняшний день считается методом выбора в лечении больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности, который позволяет заметно улучшить качество жизни, способствует более полной социальной реабилитации этой категории больных. Одним из главных факторов, вызывающих гибель функционирующей почечной ткани у реципиента после трансплантации, является острое отторжение. Под отторжением понимают воспалительное поражение трансплантата, вызванное специфической реакцией иммунной системы реципиента на трансплантационные антигены донора. В реакцию взаимодействия между иммунной системой реципиента и антигенами донорского почечного аллотрансплантата вовлечены практически все механизмы клеточного и гуморального иммунного ответа. Взаимодействие антигенспецифического рецептора Т-клеток и аллогенных HLA-антигенов - центральное событие данной реакции, а изменение морфофункционального состояния лимфоцитов имеет основополагающее значение в патогенезе острого отторжения трансплантированной почки. Количество и тяжесть перенесенных острых реакций отторжения напрямую коррелирует с потерей массы действующих нефронов и длительностью выживания трансплантата. В настоящее время диагностику острой реакции отторжения проводят на основе клинических, инструментальных и лабораторно-иммунологических данных.

Известен способ диагностики острого отторжения трансплантата (Трансплантология. Под редакцией академика В.И.Шумакова. Москва, 2006. - С.500-515), заключающийся в проведении чрезкожной биопсии почечного аллотрансплантата с последующим гистологическим исследованием биопсийного микропрепарата. Чрезкожная биопсия почечного трансплантата проводится хирургом в асептических условиях при помощи специальной биопсийной иглы под контролем ультразвукового датчика. Биоптат фиксируется в формалине, проходит этапы различных окрасок и приготовления микропрепарата. Наличие и оценка активности реакции отторжения проводится морфологом по международной классификации Banff97.

Недостатками данного способа являются инвазивность, привлечение для проведения биопсии нескольких специалистов (хирургов, цитологов и др.), использование дорогостоящих реактивов для приготовления микропрепаратов, угроза здоровью пациента в результате развития различных осложнений, таких как паранефральная гематома, гематурия, развитие артериовенозных шунтов, инфекции, вплоть до потери трансплантата.

Известен способ диагностики острого отторжения трансплантата (Синдром отторжения при трансплантации почки. Под редакцией В.И.Шумакова, Э.Р.Левицкого, Н.Ф.Порядина, Л.П.Алексеева. Москва: Медицина, 1982. - С.101-106), основанный на определении комплекса лабораторных показателей периферической крови и мочи реципиента. Исследование проводятся по стандартным общепринятым методикам, ежедневно. Определяются биохимические показатели крови: мочевина, креатинин, лейкоциты, лимфоциты, кислотно-щелочное равновесие, электролиты крови. В моче - уровень протеинурии, плотность мочи, наличие осадка мочи. Рассчитывается скорость клубочковой фильтрации. Во время развития реакции отторжения можно зарегистрировать: лейкоцитоз, лимфоцитоз, резкое увеличение уровня креатинина (на 25% от исходного) и мочевины крови, сдвиг кислотно-основного состояния крови в сторону ацидоза, гиперкалиемию; а в моче - увеличение протеинурии и снижение удельной плотности мочи; снижение скорости клубочковой фильтрации.

К недостаткам данного способа относится то, что все вышеперечисленные показатели не являются абсолютными и строго специфичными для острой реакции отторжения и могут быть проявлениями любой другой дисфункции почечного аллотрансплантата. Кроме того, метод не обеспечивает диагностику реакции отторжения в субклинической стадии, т.е. при развитии реакции отторжения без клинической дисфункции трансплантата.

Наиболее близким является способ диагностики острого отторжения почечного аллотрансплантата (Alakulppi N.S., Kyllönen L.E., Partanen J. et al. Diagnosis of acute renal allograft rejection by analyzing whole blood mRNA expression of lymphocyte marker molecules. // Transplantation. - 2007. - Vol.83, №6. - P.791-798), основанный на исследовании лимфоцитов периферической крови методом полимеразной цепной реакции для определения мРНК экспрессии маркерных молекул CD 154 и ICOS. Значения 0,87 и 0,88 показателей экспрессии генов этих молекул характеристик соответствуют состоянию отторжения почечного аллотрансплантата.

Недостатками такого подхода являются использование сложной дорогостоящей аппаратуры и реактивов для проведения молекулярно-генетических исследований, участие специально обученных высококвалифицированных специалистов, кроме того, результаты учитываются визуально после электрофореза с применением флуоресцентных красителей, что требует дополнительных затрат времени (в течение нескольких часов - от 5 часов и более). Указанные недостатки делают данный способ малопригодным для широкого использования, а тем более для мониторинга состояния лимфоцитов реципиента после трансплантации аллогенной почки.

Заявляемое изобретение направлено на создание эффективного способа диагностики отторжения почечного аллотрансплантата, не требующего дополнительного дорогостоящего оборудования и реактивов, обеспечивающего неинвазивность получения диагностического материала (лимфоциты периферической крови), оперативность выполнения (экспресс-диагностика в течение 40-60 минут), объективность и точность проведения количественной оценки морфометрических показателей живых нефиксированных и неокрашенных лимфоцитов, выявление признаков отторжения на субклинической стадии.

Для этого в способе диагностики отторжения почечного аллотрансплантата, включающем исследование лимфоцитов периферической крови, предложено исследовать живые лимфоциты методом фазово-интерференционной микроскопии. При этом определяют высоту и диаметр лимфоцитов, по которым получают значение показателя гетерогенности ядерных структур, и при значении этого показателя ниже 0,15-0,2 не менее чем у 20% клеток диагностируют начало отторжения почечного аллотрансплантата.

Предлагаемый способ основан на использовании фазово-интерференционной микроскопии живых лимфоцитов, важной особенностью которой является то, что параметры фазового изображения содержат информацию не только о пространственно-объемных характеристиках живой клетки, но и ее оптических свойствах, в частности внутриклеточной анизотропии. Величина показателя преломления, измеряемая в каждой точке цитообъекта, непосредственно зависит от концентрации, химического состава, агрегатного состояния внутриклеточного вещества, наличия или отсутствия органелл и включений. Изменение любого из указанных условий находит отражение в характерных локальных трансформациях фазового изображения клетки.

На фазово-интерференционном портрете лимфоцит идентифицируется как клетка округлой или овальной формы с плотным ядром, в области которого концентрация белка максимальна, и узким ободком цитоплазмы с низким содержанием высокомолекулярных соединений, характерных для неактивированного лимфоцита. В процессе реализации иммунологических реакций за счет активации внутриклеточных биохимических и биофизических процессов происходит увеличение диаметра клетки, измерение величины которого отражает уровень функциональной активности лимфоцита.

Ядро является доминирующим компонентом в лимфоците. Гетерохроматин может располагаться в ядре равномерно с эухроматином либо образовывать крупные конгломераты по периферии и в центре ядра. При этом известно, что конденсированный хроматин метаболически менее активен в отношении синтеза ДНК по сравнению с его диффузной формой. В процессе дифференцировки и пролиферации лимфоцитов в первую очередь меняются свойства хроматина их ядер.

Измерение фазовой высоты лимфоидной клетки позволяет количественно оценить степень упаковки хроматина в ядре: чем выше показатель, тем более плотными являются ядерные структуры. То есть данная величина отражает пролиферативный потенциал лимфоцита.

Таким образом, является очевидным, что морфометрические параметры, характеризующие количественные и качественные изменения лимфоцитов крови, могут служить высокочувствительными и объективными критериями оценки различных нарушений иммунного гомеостаза организма человека.

Способ осуществляется следующим образом.

Лимфоциты выделяют из периферической крови, стабилизированной гепарином в концентрации 25 ЕД на 1 мл, стандартным методом по Boyum на градиенте плотности для лимфоцитов (р=1.077 г/см³) (Руководство по иммунологическим и аллергическим методам в гигиенических исследованиях. Москва: ПРОМЕДЭК, 1993. - С.42-43).

Прижизненную оценку морфофункционального состояния лимфоцитов проводят с помощью фазово-интерференционного микроскопа. Измеряют высоту H и диаметр D каждого лимфоцита и рассчитывают показатель гетерогенности ядерных структур по отношению этих величин H/D. У активированного лимфоцита значение этого показателя составляет менее 0,15-0,20. В каждой пробе исследуют до 100 клеток (измерение каждой клетки не превышает 10-12 секунд). Если у 20 и более процентов лимфоцитов показатель гетерогенности ядерных структур составляет менее 0,15-0,20 - делается заключение о начале отторжения почечного аллотрансплантата.

Обоснованием для предлагаемого способа служат результаты клинико-иммунологического мониторинга 45 реципиентов почечного аллотрансплантата (у 30 из них наблюдалось безкризовое - неосложненное течение посттрансплантационного периода, у 15 - регистрировались кризы отторжения почечного аллотрансплантата). Группу сравнения составили 20 соматически здоровых добровольцев.

Параллельно с фазово-интерференционной микроскопией лимфоцитов для контроля нового способа осуществляли оценку функции пересаженного органа, а именно: определяли уровень сывороточного креатинина, скорость клубочковой фильтрации, уровень креатинина в моче, уровень сывороточной мочевины, уровень общего белка в плазме и в моче, уровень суточной протеинурии. При наличии показаний производилось морфологическое исследование трансплантата - пункционная биопсия.

Установлено, что в норме (группа соматически здоровых добровольцев) 90-100% циркулирующих лимфоцитов имеют показатель гетерогенности ядерных структур 0,20-0,30.

У реципиентов почечного аллотрансплантата при неосложненном течении послеоперационного периода и проведении стандартной индукционной иммуносупрессии значения показателя гетерогенности ядерных структур увеличиваются и, в среднем, для 60-70% лимфоцитов составляют 0,30-0,50, у остальных лимфоцитов величина показателя не ниже 0,15-0,20. При этом эффективность проводимой иммуносупрессивной терапии может быть оценена количеством клеток, обладающих показателем гетерогенности ядерных структур в рамках этого диапазона.

У реципиентов с кризом отторжения наблюдается прогрессирующее (20% и более) увеличение процентного содержания лимфоцитов с величиной показателя гетерогенности ядерных структур ниже 0,15-0,20.

Следует отметить, что повышение креатинина плазмы крови CrP более чем на 15-20% в сутки, расцениваемое в клинической практике как один из основных диагностических критериев дисфункции почечного аллотрансплантата, у этих пациентов регистрируется на 3-5 суток позже появления морфометрических признаков отторжения.

Ранняя диагностика признаков острого отторжения аллотрансплантата позволяет проводить своевременное и адекватное антикризовое лечение "пульсами" метилпреднизилона до общей дозы 1,5-3,0 г, антитимоцитарным глобулином - ATG или моноклональными антителами ОКТЗ.

Таким образом, полученные результаты продемонстрировали эффективность предложенного способа, поскольку диагностика криза отторжения во всех случаях была произведена в ранние сроки на стадии субклинических проявлений и, в последствии, подтверждена данными исследований по известным методикам. Это позволило провести своевременную и адекватную терапию, обеспечившую сохранение функции пересаженной почки и жизни пациентов.

Пример.

Больная Н., 19 лет, поступила в клинику с диагнозом: Хронический глоиерулонефрит, ХПН-терминальная стадия, левосторонний гидронефроз, хронический пиелонефрит, нефрэктомия справа в 1999 году.

Трансплантация трупной почки произведена 25.02.2006. Функция пересаженной почки немедленная. Диурез в первые сутки 2,4 литра.

Результаты фазово-интерференционной микроскопии (количество лимфоцитов с величиной показателя гетерогенности ядерных структур ниже 0,15-0,20) на 1, 3, 5, 15, 20, 24 сутки - 12%, 18%, 15%, 12%, 24%, 35% соответственно.

Увеличение на 20 сутки послеоперационного периода количества клеток с показателем гетерогенности ядерных структур ниже 0,15-0,20 до 24% было расценено как ранний признак отторжения трансплантированной почки. Первые же результаты, зафиксировавшие повышение уровня креатинина сыворотки крови до 0,54, были получены только к 24 суткам (уровень CrP на 1, 3, 5, 15, 20, 24 сутки - 1,0; 0,72; 0,47; 0,31; 0,25; 0,54 ммоль/л).

Криз был купирован внутривенным введением метилпреднизолона по 500 мг/сут в течение 3 дней.

Предложенный способ обладает рядом преимуществ: исследованием живых лимфоцитов крови, не подвергавшихся предварительной обработке, окрашиванию или фиксации, что способствует изменению их показателей; отсутствием необходимости использовать дорогостоящие реактивы и оборудование; оперативным получением высокоточных и объективных данных; использованием универсальных критериев оценки, характеризующих как морфологические, так и функциональные особенности лимфоцитов; потребностью малого (не более 3-5 мл) объема крови для проведения анализа морфофункционального состояния клеток; возможностью выявления признаков отторжения трансплантата на стадии субклинических проявлений.

Полученные результаты позволяют предполагать существенную диагностическую значимость подобной морфометрической оценки лимфоцитов периферической крови реципиентов почечного трансплантата для выявления ранних признаков отторжения почечного аллотрансплантата.

Способ обеспечивает сохранение жизни пациента, повышение эффективности диагностического и лечебного процесса, снижение инвалидизации, уменьшение сроков пребывания в стационаре. Может быть применен в обычных лабораториях медицинских учреждений.

Изобретение относится к области медицины, а именно к трансплантологии, и касается способа диагностики отторжения почечного аллотрансплантата. Способ заключается в изучении показателей живых лимфоцитов (высота и диаметр) методом фазаво-интерференционной микроскопии, по которым получают значение показателя гетерогенности ядерных структур. При значении этого показателя ниже 0,15-0,20 не менее чем у 20% клеток диагностируют начало отторжения почечного аллотрансплантата. Использование способа позволяет выявить признаки отторжения почечного аллотрансплантата на субклинической стадии.

Способ диагностики отторжения почечного аллотрансплантата, включающий исследование лимфоцитов периферической крови, отличающийся тем, что исследуют живые лимфоциты методом фазово-интерференционной микроскопии, определяют высоту и диаметр лимфоцитов, по которым получают значение показателя гетерогенности ядерных структур, и при значении этого показателя ниже 0,15-0,20 не менее чем у 20% клеток диагностируют начало отторжения почечного аллотрансплантата.