Способ определения хиноксидоредуктазной активности Советский патент 1977 года по МПК G01N33/16 

1

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в биохимических и патофизиологических исследованиях обменных процессов во всех тканях и жидкостях человека.

Известен способ определения НАД(Ф)Н никотина мид аденин динуклеотид фосфат восстановленный хинон-оксидоредуктазной активности, основанный на регистрации убыли НАДН-Н+ или НАДФН-Н+ в среде инкубации фермента путем измерения оптической плотности при длине волны 340 нм, или по восстановлению 2,6-дихлорфенол индофенол а- измерение поглощения света с лТ,линой волны 600 нм.

Однако известный способ нельзя применять, если исследуемые препараты поглощают свет в той же области спектра, что и применяемые субстраты, или сильно рассеивают свет (мутные образцы). Кроме того, при использовании этого сиособа нельзя проводить определение НАД (Ф) Н : хинон-оксидоредуктазной активности в тех объектах, в которых наряду с определяемой активностью присутствуют и другие ферменты, взаимодействующие с пиридиннуклеотидами.

С целью расширения диапазона исследуемых объектов в качестве субстрата использ)ют 4-анилин - 5 - метокси - 1,2 - бензохинон (АМОБХ) и проводят полярографическое определепие количества кислорода, подошедшего на окисление восстановленной формы этого хинона. Способ определения НАД(Ф)Н : хинон-оксидоредуктазной активности заключается в том, что определение проводят при комнатной температуре в закрытой полярографической ячейке, в которую последовательно помещают среду инкубации (солевой буфер) рН 7,5,

НАД(Ф)Н-Н+ (400 мкМ), АМОБХ (150мкМ),

дезоксихолат (1500 мкМ), цианид (2000мкМ),

после чего в ячейку добавляют исследуемый

материал.

При наличии в исследуемом материале

НАД (Ф) Н : хинон-оксидоредуктазной активности в среде, содержащей все требуемые по предлагаемому способу компоненты, начинаются реакции, протекающие в такой последовательпости:

НАД (Ф) Н H+-f АМОБХ

(Ф)+АМОБХ-Н2(1)

АМОБХ-Н2- 0,5О2 АМОБХ+Н2О (2)

Уменьшение концентрации кислорода вследствие использования его на окисление АМОБХ Н2 (реакция 2), который появляется в среде в результате НАД (Ф)Н : хинон-оксидоредуктазной активности исследуемого материала (реакция 1), измеряется полярографическп. На прилагаемой полярограмме изображена типичная кривая, отражающая изменение концентрации кислорода в среде инкубации исследуемого материала, обладающего НАД (Ф) Н : хинон-оксидоредуктазной активностью, где М - добавление исследуемого материала. По полярограмме рассчитывают максимальные скорости потребления кислорода в среде, которые равны тангенсам углов наклона касательных к кривым в точках с максимальными скоростями. Согласно представленной последовательности протекающих в ячейке реакций стехиометрические соотнощения НАД(Ф)НН+ : АМОБХ : О равны 1:1:1. Следовательно, скорость потребления кислорода в системе будет количественно отражать величину НАД(Ф)Н : хинон-оксидоредуктазной активности исследуемого материала, которая может быть выражена в едииидах: мк-атом кислорода сек-г белка или С учетом стехиометрии компонентов мк-моль НАД(Ф)Н-Н+ сек-г белка Если исследуемый материал представляет собой гомогенную систему, то определение проводят без добавления в среду дезоксихолата. Если исследуемый объект не обладает свойством поглощать кислород в результате собственного дыхания, то определение НАД (Ф) Н : хинон-оксидоредуктазной активности проводят без добавления в среду цианида. В качестве среды может быть использован любой солевой буфер изотонической пли близкой к изотонической концентрации (предночтительно использовать фосфатный буфер в концентрации 1/15 М). рН буфера может варьировать в пределах 5,5-8,5 ед. (оптимальная величина 7,5). Предлагаемый способ позволяет определить НАД (Ф) Н : хинон-оксидоредуктазную активность в образцах с различными спектральными характеристиками, в сильно рассеивающих свет или полностью непрозрачных объектах, в присутствии различных ферментативных активностей, окисляющих или восстанавливающих ииридипнуклеотиды, независимо от побочных неферментативных реакций, в которые вовлекаются ирименяемые субстраты. Формула изобретения Способ определения хинон-оксидоредуктазной активности, заключающийся в определений концентрации субстрата, отличающийся тем, что, с целью расширения диапазона исследуемых объектов, в качестве субстрата используют 4-анилин - 5 - метокси-1,2 - бензохинон и проводят полярографическое опре деление количества кислорода, пощедщего на окисление восстановленной формы этого хинона.