Способ витальной микроскопииНЕРВНОгО ВОлОКНА Советский патент 1981 года по МПК A61B10/00 G01N33/48 

1

Изобретение относится к нейробиологии и может быть использовано при морфофизиологических исследованиях состояния нервного волокна.

Известен способ витальной микроскопии нервного волокна, предусматривающий расщепление нерва на волокна и выделение одиночного прикрытого или неприкрытого перехвата Ранвье 1.

Однако известный способ не позволяет определить функциональное состояние микроскопируемого волокна.

Цель изобретения - определение функционального состояния нервного волокна.

Это достигается тем, что на препарате последовательно определяют форму луковицы и конуса и измеряют величину щели между ними, и при форме луковицы от щаровидной до полусферы и размерах щели от 4 до 7 мкм определяют необратимо измененное волокно, при шаровидной форме луковицы с расщепленным конусом и размерах щели от 2 до 4 мкм определяют обратимо измененное волокно, а при щаровидной форме луковицы с нормальным конусом и размерах щели от 0,3 до 2 мкм волокно определяют как нормальное.

Морфологическая характеристика изменений волокна иллюстрируется чертежом, где а - форма конусов от правильной до

появления расщепления у вершины одного из конусов (зазубренность) ,3- 2 мкм; б - от зазубренности вершины до полного исчезновения одного из конусов, / 2-4 мкм; 0 - от начала расслоения миелина луковицы до ее выраженного расслоения (форма от начальной шаровидной до полусферической), / 4-7 мкм.

Для удобства и облегчения определения функционального состояния волокна при витальной микроскопии необходимые параметры сведены в сопоставительную морфофизиологическую таблицу, соотнесенную с иллюстрацией морфологической картины изменений волокна (см. чертеж).

Способ осуществляют следующим образом. Обычным способом изолируют седалищный нерв лягушки. Затем его помещают в раствор Рингера (температура 22°С, рН 7,3) и препарируют под лупой с попеременным расслоением и отсечением нервных пучков. Препаровку ведут сменными заточенными стальными иглами. По мере .изоляции волокна выбирают менее острые иглы.

Волокно в области едва угадываемого перехвата обнажают на расстоянии 1- 2 мм. Остальные его участки остаются в составе нервных стволиков. Из смеси воска и вазелина на покровном стекле готовят емкость, залитую раствором Рингера. Выделенное волокно (диаметром 8-12 мкм) под МБС-2 укладывают на гистологическую лопатку и осторолшо переносят в емкость. После смывания волокна с лопатки в емкость лишнюю жидкость отсасывают. Емкость закрывают вторым покровным стеклом. Образовавшуюся таким образом микрокамеру переносят под микроскоп типа МБИ.

Сначала препарат изучают и фотографируют под обычным микроскопом МБИ-З с насадкой МФН-И в проточном растворе Рингера, зарисовывают, измеряют, а затем исследуют физиологические параметры мембраны по методике фиксации потенциала. Для этого волокно переносят в электрофизиологическую камеру, поверх смежных интернодальных сегментов накладывают вазелиновые перегородки. Концы волокон не перерезают, а размеш,ают вместе с кусочкамп ствола в соседних отсеках камеры, содержап;их изотонический раствор 114 мм/л КС1.

Вначале определяют способность перехватов генерировать потенциал действия, а затем с помош,ью методики фиксации напряжения регистрируют ионные токи перехвата. Натриевые токи (/Na) определяют по величине пика входящего тока, а калиевые (/к) - по стационарному уровню тока при длительности импульсов 5 мс. Линейную компоненту ионного тока (ток утечки /i) измеряют с помощью гиперполяризующих импульсов той же длительности. Из вольтамперных характеристик находят значение натриевой (GNa) п калиевой (Ок) проводимостей при мембранном потенциале . Вычисляют также проводимость утечки GI. В качестве физиологических иараметров, не зависящих от калибровки измеряемой величины t/E , выбраны отношения проводимостей GNa/Gi и GK/GI, учитывая их важную роль в генерации потенциала действия.

Пример 1. При микроскопическом анализе под объективом 10Х у препарата первпого мякотного волокна диаметром около 12 мкм форма луковицы перехвата была оценена нормальной. При последуюигем анализе под средним (40Х) увеличеппем конус перехвата квалифицирован как незначительно измененный за счет начального расслоения миелина. Расстояние между мякотными конусами 1,5 мкм. Волокно признано нормальным. При электрофизиологической проверке функциональные характеристики ионных каналов, непосредственно измеренные в дальнейшем ходе опыта, составляли величины: Gxa/Gi 13; GK/GI 7; GNa/GK -l,9; G, 0,022. Потенциал действия генерируется. Вольт-амперные характеристики свидетельствуют о хорошем функциональном состоянии мембрапы, что подтверждает нормальное состояние волокна.

Пример 2. При микроскопическом анализе перехвата под малым (10Х) увеличением (диаметр волокна 10 мкм) форма луковицы была оценена как нормальная. При последующем анализе под объективом 20Х заметно полное исчезновение одного из конусов. Второй конус резко деформирован расслоением миелина и едва заметен. Измерение с помощью микрометра расстояния между смежными сегментами ретрагированного миелина равно 3,8 мкм. Волокно определено обратимо измененным.

Проверочные измерения в установке для фиксации потенциала выявили следующие удовлетворительныехарактеристики:

GNU/GI 3; GK/GI 5,5; GNa/GK 1,5; GI 0,2. Потенциал действия, однако, не возникал. Это подтверждает функциональное обратимое состояние волокна.

Пример 3. При микроскоиическом анализе уже под объективом 10Х обнаруживается деформация обеих луковиц перехвата. В результате расслоения миелина и его ретракции левая луковица вместо сферической формы имеет контур в виде зазубренной полусферы. Правая луковица деформирована слабее. Расстояние между миелином измененных смежных сегментов 6,5 мкм. Волокно определено как необратимо измененное.

В данном конкретном опыте электрофизиологическая проверка выявила следующие величины: G fa/Gl 2,3; GK/GI 2,7; GNa/GK 0,8; G 0,4. Это функциональное состояние такого волокна следует оценить как необратимо измененное.

Предлагаемый способ позволяет с помощью морфологических исследований и измерений количественно определить некоторые физиологические характеристики аксона. Это реализуется путем микроскопического

айалнза и изме рёния степени повреждения элементов глиальной шванновской клетки, тесно связанных функционально и морфологически с аксолеммой в зоне перехвата. Этот способ существенно облегчает работу с препаратом, дает возможность планнровать вид эксперимента, экономит время исследователя.

Изобретение позволяет расширить исследования нервного волокна при травме нерва и влиянии специфических токсинов. Выявленные соответствия физиологического состояния морфологическим характеристикам позволяют охарактеризовать изменения как допускающие или ограничивающие дальнейшие действия при лечении или инструментальном электрофизиологическом исследовании.

Формула изобретения

Способ витальной микроскопии нервного волокна, предусматривающий его расщепление, выделение одиночного перехвата Ранвье, отличающийся тем, что, с целью определения функционального состояния нервного волокна, на препарате последовательно определяют форму луковицы и конуса и измеряют величину щели менаду ними, и при форме луковицы о г шаровидной до полусферы и размерах щели от 4 до 7 мкм определяют необратимо измененное

волокно, при шаровидной форме луковицы с расщепленным конусом и размерах щели от 2 до 4 мкм определяют обратимо изменение волокна, а при шаровидной форме луковицы с нормальным конусом и размерах

щели от 0,3 до 2 мкм определяют нормальное волокно.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Сотников О. С. Функциональная морфология живого мякотного нервного волокна. Л., Наука, 1976, с. 17-31.

.«

U

М