Способ перфузии растительных клетоки уСТРОйСТВО для ЕгО ОСущЕСТВлЕНия Советский патент 1981 года по МПК C12K1/10 

Изобретение относится к биологии применяется при исследовании физикохимических свойств биологических мем бран. Известен способ перфузии клеток путем пропускания искусственного кле точного сока через торцы клетки, при чем концы клетки отрезают, вводят в них канюли, через которые пропускают искусственный вакуолярный сок. Устройство для осуществления этого способа содержит камеру для закрепления клетки, микроишанг, соединенный с микроворонкой и канал для выведения сока из клетки. Микрошланг вставляют в канюлю, закрепленную в клетке, и через воронку подают искусственный вакуолярный сок. Вытекание сока происходит через второй отрезанный конец клетки tl Недостатком известногЪспособа и устройства для его осуществления является снижение жизнеспособности клетки вследствие ее повреждения и значительного снижения давления внут ри клетки. Перфузированные таким образом клетки сохраняют жизнеспособность лишь 1,5-2 ч. Исследуемые физи ко-химические характеристики изменяются в процессе перфузии. Кроме того при снижении давления в клетке невозможно снимать электрические харак теристики между цитоплазмой и наружной средой, поскольку клетка харовой водЬросли представляет собою цилиндр, пристенный слой которой толщиной 1015 мкм представдген цитоплазмой, а остальную часть (90% объема) занимает вакуоль; мембрана, прилегающая к оболочке, называется плазмалеммой, вакуоль от цитоплазмы отделяется второй мембраной - тонопластом. При пер фузии происходит замена именно вакуолярного сока. Если же концы клетки отрезают, то давление цитоплазмы и давление внутри вакуоли резко падает, и наружная мембрана - плазмалемма - опадает, смыкаясь с внутренней тонопластом, В таких случаях невозможно с помощью микроэлектродной техники снять электрические характеристики между цитоплазмой и наружной , т.е. плазмалеммы. Цель изобретения - сохранение жизнеспособности клеток в течение естественного времени их жизни, снижение травматичности клеток и поддер- . жания в них естественного внутриклеточного давления. Поставленная цель достигается тем, что торцы клеток прокалывают микро- иглами, через.которые осуществляют перфузию, при этом выход канала для введения в клетку искусственного ваку олярного сока снабжен микроиглой, а микроигла на входе канала для вывода сока из клетки снабжена подвиж ным в продольном направлении конусо-, образным стержнем, соединенным через пружину с тросиком. На чертеже изображена схема устрой ства для осуществления предложенного способа. Канал для введения в клетку искусственного вакуолярного сока содержит шприц 1, который через микрошланг 2 соединен с микроирлой 3. Микрошланг 2 снабжен манометром 4, микрокраном 5 и демпфером 6. Канал.для вывода сока из клетки содержит шприц 7, которы через микроишанг 8, снабженный манометром 9 и микрокраном 10, соединен с микроиглой 11, во внутренней полости которой подвижно в продольном направлении установлен конусообразный стержень 12, соединенный с тросиком 13, через пружину 14. В камере 15 закреплена исследуемая клетка 16., Предложенный способ осуществляется следующим образом, Клетку водоросли 16 .укрепляют вкамере 15. Шприц 1 заполняют искусственным вакуолярным соком. Гидростатическое давление в штрице 1 усуанавливают 6-7 атм (равное естественному внутриклеточному давлению), после чего торец клетки прокалывают микроиглой 3, предназначенной для подачи перфузата (искусственного вакуолярного сока). Давление в шприце 7 устанавливают такое же, как и в шприце 1 и прокалывают другой торец клетки ми роиглой 11, предназначенной для выте кания сока. Затем давление в шприце 1 повышают и производят замену внутриклеточного сока.. Устройство для осуществления пред ложенного способа работает следующим образом. Шприцы 1 и 7 заполняются искусственный вакуолярным соком,который заполняет также микрошланги 2 и 8 и ми роиглы 3 и 11,после чего микрокраны и 10 перекрываются, причем микрошлан ги 2 и 8 заполняются саком таким обр зом, что в них остается по пузырьку

воздуха.

После этого микроигла 3 вводится в торец клетки, давление в шприце 1 устанавливается 6-7 атм и микрокран 5 открывается. При этом пузырек воздуха в микрошланге 2 передвигается либо вверх, либо вниз, в зависимости от разности давлений в клетке 16 и шприце 1. Изменением давления в шприце 1 движение пузырька воздуха останавливается, что означает выравнивание давлений в клетке

1.Способ перфузии растительных клеток Путем пропускания искусственного вакуолярного сока через торцы клетки, отличающийся тем, что, с целью сохранения жизнеспособности

клеток в течение естественного времени их жизни,- торцы клеток прокалывают микроиглами, через которые осуществляют перфузию.

2.Устройство для осуществления

способа по -п.1, включающее камеру для 16 и шприце 1. После в шприце 7 устанавливается такое же давление как и в шприце 1 (его показывает манометр 4) . Это естественное гидростатическое давление данной клетки. Стержень 12 с помсяцью пружины 14 плотно закупоривает входное отверстие микроиглы 11. При таком положении стержня 12 микроигла 11 вводится в другой торец клетки. После этого открывается микрокран 10, а стержень 12 с помощью тросика 13 оттягивается и открывает входное отверстие микроиглы 11. Далее в шприце 7 все время поддерживается постоянное давление, равное внутриклеточному, а в шприце 1 давление повышается до 8-1Q в зависимости от необходимой в данном эксперименте скорости перфузии. Сопротивление демпфера 6 Подбирается также в зависимостиот необходимой скорости протекания искусственного сока через клетку. Скорость же перфузии определяется с помощью пузырька воздуха, движущегося под давлением в калиброванном микрошланге 2, и секундомера при известности диаметра микрошланга 2 и внутреннего объема клетки. При необходимости увеличить или уменьшить скорость перфузии увеличивается либо уменьшается давление в шприце 1. Демпфер 6 сбрасывает разность давления между шприцами,и давление в микроигле 3 равновнутриклеточному. Таким образом, предложенный способ перфузии растительных клеток и устройство для его осуществления позволяют сохранить жизнеспособность клетки в процессе перфузии за счет значительного снижения травматичности клетки и поддержания ее естественного давления. Это позволяет снимать в процессе перфузии физико-химические характеристики нормально функционирующей клетки, а также измерять дополнительные параметры, например физико-химические характеристики между Цитоплазмой и наружной средой. Таким образом, как и на интактной .(естественной) клетке, возможно регистрировать электрические параметры каждой мембраны - плазмалеммы и тонопласта отдельности, Формула изобретения

закрепления исследуемой клетки, каналы для введения и вьщеления искусственного вакуолярного сока, о т л ич а ю щ е-е с я тем, что, с целью снижения травматичности клеток и подцер;жакия в них естественного внутриклеточного давления, выход канала для введения в клетку искусственного ва- куолярного сока снабжен микроиглой, а микроигла на входе канала для вывода |сЬка из клетки снабжена подвижным в i. продольном направлении конусообразным

стержнем, соединенным через пружину :С тросиком.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Берестовский . Г. И. Методически особенности внутриклеточной перфузии и фиксации напряжения на клетках NiteXIopsis obtusa. Харовые водоросли и их использование в .исследовании биологических процессов клетки. Сборник, 1973, с.243-259.