Способ изготовления камеры дляКульТиВиРОВАНия КлЕТОК Советский патент 1981 года по МПК C12K1/00 

t

Изобретение относится к микробиологическим и гематологическим видам исследованийг связанных с выращиванием клеток in vitro и in. vivo и может быть исследовано в микробиологических, гематологических, им syнологических и других исследованиях при создании камер для закономерностей роста и развития клеток (микро,организмов, тканевых клеток) и определения влияния на них различных факторов.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ изготовления камеры для культивирования клеток, заключающийся в том, что формируют стенки и днище с образованием полости для взвеси клеток, закрывают крышкой и герметизируют.

Стенки камеры по известному способу изготавливают из пластмассовых колец, а крышку изготавливают из ниллипоровых фильтров путем наиесения на фильтр насечек, стерилизации и вырезания затем кружков. Полученные кружки тщательно приклеивают к кольцам клееМг полученным путеп растворения фильтров в ацетоне- так, чтобы матовая сторона их была обращена к клеткам (она считается менее токсичной). Затем камеры в разобранном виде помещают в чашки Петри и стерилизуют под лучами бактерицидной лампы. Б последующем кольца с фильтрами помещают на увлгикненные средой 199 стерильные марлевые салфетки, В кольца Еносят среду 199 для проверки качества фильтра и герметичности камеры. В стерильных условиях на

0 фильтры в кольца помещают исследуемую суспензию клеток, .Ожидают, пока культуральная просочится через фильтры и на них останутся только клетки. Потом накладывают кольца

5 друг на друга (меньшее в большее), придавливают сверху лопаткой для сопоставл-эния и герметизируют, проклеивая щель между ними клеем. Полученные таким образом камеры имплантируют в I организм животного 1.

0

к недостатксЦ известного способа относятся сложность и трудоемкость изготовления большого количества камер, а также то, что полученные ка5меры, хотя и позволяют выращивать клетки iin vivo и in .vitro, однако они выполнены из :оптически непрозрачных материалов, что не позволяет осуществлять наблюдение за одни0 мн и теми же отдельными клетками в

динамике их роста и развития непосредственно в камере; для изучения исследуемых клеток камера, в которой они выращивались, должна быть демонтирована, клетки извлечены и перенесены на предметное стекло, что нарушает первоначальное взаимораспо ложение клеток, их форму и размеры. Часть клеток может разрушаться. Камера .не позволяет осуществлять непосредственное наблюдение за ростом, размножением и дифференцировкой исследуемых клеток под контролем микроскопа в состоянии их развития. Камера имеет жесткую структуру, что отрицательно влияет на организм животного при имплантации. Методика не позволяет получать одновременно необходимое количество кайер, так как каждая из них готовится .отдельно.

Цель изобретения - упрощение, удешевление способа и возможность исследования клеток в камере на разных этапах их развития.

Для достижения этой цели стенки днища и крышку выполняют из полиакриламидного геля, при этом стенки и днище формируют, заливая рабочий раствор в пространство между- двумя параллельными пластинами, верхняя из которых имеет выступы для образования полостей в нижней пластине,, полимеризуют смесь до образования геля и снимают верхнюю пластину, а герметизацию камеры проводят путем наложения сверху листового материала с образованием зазора между ним и крышкой, заливают рабочий раствор и полимеризуют до образования геля, снимают листовой материал и выштамповывают камеру. .На фиг.1 изображена камера для культивирования клеток, общий вид; на фиг. формирование полосы для размещеьС1я клеток; на фиг. 3 - приготовление плоской гелевой пластины; на фиг.4 - введение в полости суспензии клеток и накладывание крышек; на фиг.5 - герметизация камер путем закрепления крышек в гелевой массе; на фиг. 6 - вырез.ание камер.

Камера готовится следующим образом.

Берут четыре плексигласовые пластины 1-4. На поверхность пластины 1 в шахматном порядке на расстоянии примерно 15-2О мм приклеивают водостойким клеем предварительно вырезанные из пластика или медицинской резины плоские кружки 5 диаметром 6 мм и толщиной 1-2 мм (фиг.2а). Пластины стерилизуют кипячением.

Пластину 1 накладывают на прямоугольные плексигласовые подставки б толщиной 2-3 мм, расположенные по бокам пластины 2 таким образом, что-: бы плоскость с приклеенными кружками 5 пластины 1 была обращена к пластине 2 (фиг.2а,б). Пластину 3

накладывают на прямоугольные плексигласовые подставки 7 толщиной 1г2 мм расположенные по бокам пластины 4 (фиг.За,б). Профильтрованные через бактериальные фильтры рабочие растворы для получения полиакриламидного геля смешивают (стерильно) и заливают в пространство между пластинами 1 и 2 (фиг.26) и 3 и 4 (фиг.36). При этом капиллярные силы удерживают жидкость между пластинами, смесь растворов полимеризуют через 1520 мин (в зависимости от режима полимеризации) . После этого пластины

1и 2 снимают с подставок. На пластине 2 остается гелевая пластина с полостями 8 (фиг.2в)-, а на пластине 4 плоская гелевая пластина (Фиг.Зв).

Из плоской гелевой пластины сверлами для пробок вырезают кружки, выполняющие функцию крышек 9, диаметр которых на 2-3 мм больше диаметра полостей 8. В полости 8 вносят исследуемые клетки (фиг.4а). Сверху полости 8 покрывают крышками 9.

При исследовании в камере неприкреплякидих клеток (например,подвижных микроорганизмов) последние прижимают ко дну луночки гелевым кружком, диаметр которого соответствует диаметру луночки. При этом камера будет без внутреннейполости.

Герметизацию камеры осуществляют следующим образом.

По бокам плексигласовой пластины

2устанавливают подставки 10 таких размеров, что после положения на них листового материала или пластины 3 образуется зазор в 1-2 мм между

этим материалом (пластиной) и крышкой 9. В образовавшееся пространство заливают смесь рабочих растворов которая, полимеризуясь, соединяет пластины между собой (фиг.56) . Листовой материал (плексигласовую пластину 3) снимают с подставок 10. Сверлами для пробок диаметром 1215 мм вырезают камеры.

Изготовленные камеры отмывают в физиологическом растворе NaCI растворе Хенкса, среде 199 в зависимости от того, какие клетки подлежат исследованию. В дальнейшем камеры имплантируют в организм животного или помещают в питательною среду- при культивировании in vitro.

Методика предусматривает изготовление одновременно камеры различных размеров и в необходимом количестве в зависимости от целей исследоваиия.

Камеры, изготовленные- по предлагаемому способу из полиакриламидного геля, обеспечивают возможность изучения одних и,тех же отдельных клеток в динамике их роста и развития. Для этого клетки подвергают микроско пированию непосредственно в камере. Для облегчения нахождения клеток в камеру совместно с клетками при их

посеве моясно вводить специальные маркеры (частицы активированного угля, убитые дрожжевые клетки и да.) Через необходимое время камеры извлекают из организма .или питательной среды Под микроскопом находят ту же группу клеток и подвергают исследованию. При необходимости пастеровской пипеткой клетки могут быть извлечены . Камеру можно повторно имплантировать в организм или помечать в питательную среду.

Изготовление камер из полиакриламидного геля обеспечивает опт ическую прозрачность, которая позволяет проводить наблюдения исследуемых клеток световой микроскопией в динамике их роста и размножения. Камеры эластичны, xopotdo переносятся животными и обладают способностью конфигурировать в полостях при имплантации в организм даже пРи одновременной имплантации одному животному 2-3 камер.

Основньв 1и преимуществакш изготовленных камер данным способом являются оптическая прозрачность, эластичность, биологическая инертность используемого для изготовления камер материала. Способ их изготовления более прост, доступен и позволяет одновременно получать необходимое количество камер.

Формула изобретения

Способ изготовления камеры для культивирования клеток, заключающийся в том, что формируют стенки и днище с образованием полости, закрывают кЕялшкой и герметизируют, отличающийся тем, что, с целью упрощения, удешевления способа и возможности исследования клеток в камеру на разных этапах их развития,

o стенки, днище и крышку выполняют из полиакриламидного геля, при этом стенки и днище формируют, заливают рабочий раствор в пространство между двумя параллельными пластинами,

5 верхняя из которых имеет выступы для образования полостей в нижней пластине, полимеризуют смесь до образования геля и снимают верхнюю пластину, а герметизацию камеры про0водят путем наложенияiсверху листового материаша с образованием между ним и крьаикой, заливают рабочий раствор и полимеризуют до образования геля, снимают листовой материал и выштамповывают камеру.

5

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Евгеньева Г.П. Межклеточные взаимодействия и их роль в эволю0

ции. М.,Наука

1976, с.31-37.

Фие.1

rСуспензия клеток

fus.

if :-t ф:

VX