Полиакриламидный гель для медико-биологических целей и способ его получения Советский патент 1982 года по МПК C08F220/56 C12Q1/00 C12N5/00 

Изобретение относится к химии полимеров, в частности к полиакриламидному гелю, предназначенному для использования в педицинских и биологических целях.

Полиакриламидный гель известен сравнительно давно и используется в настоящее время в медицине и биологии исключительно для сепарации различных веществ.

Однако возможности применения полиакриламидного геля для других .целей в медицине и биологии ограничиваются наличием в негч токсичных исходных мономеров,

Известен полиакриламидный гель, содержащий в качестве oqHOBH сополимер акриламида и N,N -метилен-бис -акриламида, использующийся для выращивания различных микроорганизмов.

Указанный гель получают радикальной сополимеризацией акриламида с N,N -метилен-бис-акриламидом в при-, сутствии анициатора и активатора радикальной полимери-зации в водных растворах при содержании 3-20 вес.ч. воды на 1 ч ,сомономеров, смесь сомономеров содержит 0,01 0,25 ч N,N -метилен-бис-акриламида на 1 ч акриламида.

При этом в исходную среду при синтезе геля могут быть введены неорганические соли в относительно высокой конце 1трации, а также различные другие добавки для обеспечения питательных потребностей отдельных видов микроорганизмов fl.

Недостатком указанных гелей является то, что они содержат опреде10ленное количество токсичных исходных мономеров. Кроме того, так как гели имеют кислую реакцию (рН 3,5-4), не любые питательные субстраты могут быть введены в них. Это обстоя15тельство ограничивает возможность их использования.

Наиболее .близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является полиакрила20мидный гель для медико-биологических целей, включающий сетчатый сополимер акриламида и N, N-петилен-бис-акриламида и воду в качестве среды набухания. Этот гель использу25ется в качестве плотной основы для приготовления питательной среды, применяемой для выращивания различных микроорганизмов.

Гель получают радикальной сополи30 меризацией акрилагшда с N, N-метилен-бис акриламидом и вещном раство ре в присутствии инициатора и активатора радикальной полимеразции с последующей отмывкой геля водой от 1иэкомолекулярных примесей. Известный способ позволяет получить нетоксичный гель, который может быть использован при виращивании большинства видов микроорганизмов 2. Однако отг/1ывка целевого продукта хотя и позволяет удалить токсичные вещества, но не обеспечивает возгюж кости безвредного контакта полученного геля с клетками, тканями и органами животных и человека, так как не обеспечивает условия изоосмо тичности, что сужает область его ис пользования в медицине и биологии. Кроме того, качество полиакриламидного геля,который используют как ос нову для выращивания микроорганизмо остается недостаточно высоким. Цель изобретения - расширение фу циональных возможностей геля и улуч шения его эксплуатационных характеристик. Указанная цель достигается тем, что полиакриламидный гель для медико-билогических целей, включающий сетчатый сополимер акриламида с -метилен-бис-акриламидом и среду на бухания, в качестве среды набухания содержит физиологический раствор пр следующем соотношении компонентов, мае.%: Сетчатый сополимер 3,0-28,0 Физиологический раствор72,0-97,0 Предлагаег1ый гель получают путем радикальной сополимеризации акрилам да с N,N-метилен-бис-акриламидом в присутствии инициатора и активато ра радикальной полимеризации с последующей отмывкой геля от низкомоле кулярных примесей, при этом осуществ ляют и отмывку геля в физиологическо растворе при следующей исходной концентрации мономеров, мае.%: Акриламида 0,5-40 N,N-метилен-бис-акриламида 2,5-12 Получаемый полиакриламидный гель не токсичен и обладает высокой пористостью, гидрофильностью, эластичностью, прозрачностью, термостабильностью. Кроме того, он обладает изоосмотичностью-с биологическими систе мами (микроорганизмами, клетками, тканями, органами), что позволяет стабилизировать его размеры в биологических системах, а также повысить насыщение его растворами различных веществ. Все это дает возможность осуществить безвредный контакт полиaкpилa rи u oгo геля с биологичр.скими системами и тем самьтм значительнс расширить возможность использования его в медицине и биологии. Целесообразно для расширения возможности использования полиакриламидного геля в медицине и биологии в качестве физиологического раствора использовать 0,5%-ный водный раствор хлористого натрия или 0,9%-ный водный раствор хлористого натрия, раствор Рингера-Лока, раствор Эрла, раствор ХэН1$са, среду 199, среду Игла, 5%-ный водный раствор глюкозы. Рекомендуется чтобы полиакриламидный гель в качестве физиологического раствора содержал 0,5%-ный водный раствор хлористого натрия, при следукщем содержании компоне 1тов, мас.%: Полиакриламид 6,0-15,0 0,5%-ный водный раствор хлористого натрия 84-94 Указанная модификация полиакриламидного геля позволяет получить наиболее оптимальную изоосмот1гчность с микроорганизмами, что позволяет использовать ее в качестве плотной основы питательных сред для культивирования микроорганизмов. Возможно, чтобы полиакриламидный гель в качест.ве физиологического раствора содержал 0,9%-ный водный раствор хлористого , натрия при следующем содержании компонентов, мас.%: Полиакриламид 5,0-13,0 0,9%-ный водный раствор хлористого натрия 82,0-95,0 Указанная модификация полиакриламидного геля позволяет получить наиболее оптимальную изоосмотичность с клетками животных и человека, что позволяет использовать ее в качестве носителя питательных субстратов при культивировании культур клеток. Предлагается, чтобы полиакриламидный гель в качестве физиологического раствора содержал 5%-ный водный раствор глюкозы при следующем содержании компонентов, мас.%: Полиакрилшлид 4,0-20,0 5%-ный водный раствор глюкозы 80,0-96,0 Указанная модификация полиакриламидного геля обеспечивает оптимальную изоОсмотичность с биологическими свойствами и применяется в тех случаях, когда присутствие хлористого натрия не;хелательно. Целесообразно применять полиакриламидный гель в качестве питательной среды. Питательные среды, где в качестве плотной основы применен полиакриламидный гель, содержащий физиологический раствор, не содержат посторонних примесей, обладают микробиологической воспроизводимостьп, стабильностью. Они хорошо держатся в чашках Петри, устойчивы к высыханию, поддаются длительному хранению и имеют ряд существенных преимуществ перед известшлпи средами.

С целью уменьшения; травматизации тканей глаза при имплантации посредством выполнения минимальных разрезов ,обеспечения: полной ареактивности оболочек глаза, реког1ендуется применять указанный выше полакриламидный гель в качестве искусственного хрусталика.

С целью обеспечения длительного непрерывного ношения при коррекции аномалии рефракции в широких пределах, предлагается применять полиакриламидный гель в качестве контактной линзы.

Полиакриламидный гель получают путем полимеризации акрнламида и -метилен-бис-акрилаглида. Реакционная мономерная смесь обычно содержит 80-99,5 мас.% акриламида, 0,520 мас.% N N-метилен-бис-акриламида. Исходные мономеры растворяют в физиологическом растворе, В качестве физиологического раствора используют 0,5%-ный водный раствор хлористого Натрия или 0,9%-ный водный раствор хлористого натрия, 5%ный водный раствор глюкозы, или растворы Рингера-Лока, Хенкса, Эрла, или среды 199, Игла и другие.

Варьируя количество исходных мономеров в реакционной смеси можно получать Полиакриламидный гель различной плотности и эластичности.

Полимеризация исходных мономеров может протекать без нагрева или при нагревании реакционной смеси, добавлении известных инициаторов, катализаторов. Скорость реакции полимеризации прямо пропорциональна температуре, количеству катализатора. O6tJ4Ho катализаторы добавляют в количестве 0,05-0,1 мас.% от количества исходных мономеров.

Реакционная смесь может быть приготовлена путем смешивания сухих порошкообразных мономеров с последующим растворением в физиологическим растворе. Для ускорения растворения физиологический раствор нагревается. Полимеризация реакционной смеси может осуществляться в объеме заданной формы - в стеклянных, металлических, керамических емкостях, а также емкостях из синтетических материалов. Получаемый в процессе полимеризации гель повторяет форму и размеры используемой емкости.

Процесс полимеризации можно осуществлять в объемах, моделирующих форгду известных контактных линз, либо форму известных монолитных искусственных хрусталиков, что позволяет использовать Полиакриламидный гель в качестве ягкoй контактной линзы, либо в качестве искусственного хрусталика. Условия проведения процесса полимеризации аналогичны

приведенным выше.

Отмывка геля от токсичных продуктов может осуществляться в обычных условиях и при повьоиенной температуре. При этом исходные (токсичные)

компоненты растворяются и переходят из геля в физиологический раствор. Заменяя физиологический раствор, удается полностью удалить из геля токсичные продукты. Обычно для этогр достаточно троекратной смены раствора. Нагревание ускоряет процесс oTtiHBKH геля. Процесс отмывки геля осуществляется аналогично описанному выше и при получении мягкой кон-

тактной линзы или хруста/тика. Полученный гель поддается штамповке, разрезанию.

Стерилизация геля может быть осуществлена тегтературныи, радиационныг и химическим путем. Выбор метода стериализации и его режим определяются условиями конкретной задачи.Таким образом, гель становится пригодным для использования в качестве плотной основы для получения питательных сред, с целью культивирования микроорганизмов, либо искусственного хрусталика, либо мягкой контактной линзы и может храниться до момента его и спользования.

Насыщение геля субстратами для питания микроорганизмов и культур клеток может быть осуществлено до или после стерилизации. Выбор метода

насыщения определяется конкретным составом питательного субстрата. При наличии в питательном субстрате термолабильных компонентов насыщение осуществляется после стерилизации.

Состав питательных субстратов определяется пищевыми потребностями конкретных групп или видов микроорганизмов и клеток. Для насыдения полученного в соответствии с изобретением полиакриламидного геля могут быть использованы питательные субстраты, обеспечивающие пищевые потребности практически всех известных видов микроорганизмов и клеток, включая

натуральные, полусинтетические и синтетические составы субстратов или их смеси.

Для определения качества питательных сред, где в качестве плотной основы использован полиакриламидныП гель, содержащий физиологический раствор, а также изучения биологических свойств микроорганизмов, клеток животных и человека используются известные г-5етоды исследования. Известными методами определяются также оптические свойства мягких контактных линз и искусственных хру таликов из полиакриламидного геля, содержаидего физиологический раствор Полиакриламидный гель использоваться ц качестве носителя (плотной основы) питательных субстр тов, необходимых для роста, размножения и развития микроорганизмов. Пластины полиакрилаг 1{дного геля могут выполняться круглыми по диаметру чашек , квадратнЕлг- и или прямоугольныг и по размерам покровных и предметных стекол, а также в виде блоков различных размеров и фо мы и использоваться после насыщения питательными субстратами для макрои микрокультивирования различных групп, видов и штзалмоз микроорганиз мов, клеток животных и человека. Использование полакриламидного геля в качестве плотной основы пита тельных сред обеспечивает последним микробиологическую инертность, что повышает выход биомассы микроорганизмов. Получение пластин полиакриламидного геля может быть автоматизировано,. Пластины геля не требуют специаль ных методов стерилизации.. Стерилизацию их можно осуцеств; лять oбщeпpиняты 1и методами и в обыч ньох условиях. Наприг.тер в автоклаве при давлении 1-1,5 атм или текучим паром. Возможно хранение готовых к употреблению пластин полиакриламидного геля длительное время. Полиакриламидный гель имеет известный и постоянный состав, что обеспечивает воспроизводимость плотной основы питательных сред и связанную с этим стандартизацию микробиологических исследований, позволя ющую сопоставлять результаты различ ных исследований. Использование полиакриламидного геля в качестве гдягкой контактной линзы может обеспечить коррекцию зре ния от-20 ОД до+20 ОД.. Кроме этого, мягкие контактные линзы могут быть использованы одновременно с лечебной целью для пролонгированного действи лекарственных веществ (антибиотиков сульфаниламидов, мидриатиков, миоти ков и др. препаратов). Представляется возможным примене ние мягких контактных линз в качест ве дополнительного звена при герметизации раны при ургенных и плановы операциях на глазу или в виде самостоятельного способа в тех же ситуа циях. Линза из предлагаемого полиакрил мидного геля может быть использована так) с косметической целью и как средство уменьшения светорассеяний при аниридии, иридодилазе, стойком мидриазе, альбинизме. Полиакриламидный гель может быть применен в качестве искусственного хрусталика и использован для коррекции аномалий рефракции после экстракапсулярной экстракции катаракты одномоментно или в качестве второго этапа. Хрусталик может Иметь заданные формы, размеры и оптическую силу. Пример 1. Для получения полиакриламидного геля согласно изобретению готовят три раствора (А, В и с) по следующей методике (указаны количества исходных компонентов из расчета на 1000 мл основного раствора) . Приготовление раствора А: 5 мл тетраметилэтилендиамина растворяют в 995 мл 0,5% водного раствора хлористого натрия и хранят в темной посуде при 4°С в условиях холодильника до употребления (срок хранения 6-8 месяцев). Приготовление раствора В: 7,35 г метилен-бис-акриламида растворяют в 350 МП 0,5%-ного водного раствора хлористого натрия, подогретого до , а затем добавляют 280 г акриламида, который размешивают до полного растворения. Полученный раствор фильтруют через ватно-марлевый фильтр , добавляют до 1000 мл 0,5%-ного водного раствора хлористого натрия и хранят в темной посуде при в условиях холодильника до употребления (срок хранения 6-8 месяцев). Приготовление раствора Ct 1,4 г персульфата аммония растворяют в 1000 мл 0,5%-ного водного раствора хлористого натрия и хранят в темной посуде до употребления (срок хранения 4-6 недель). Из приготовленных растворов 1А, В и с) готовят реакционную смесь. Для этого к 1 объему раствора А добавляют 2 объема раствора В и 4 объема раствора С. (Объемные соотношения основных растворов могут быть изненены в зависимости от необходимой эластичности или плотности геля). Реакционную смесь заливают в щель, образованную двумя плоскопараллельными стеклянными пластинами толщиной 3 мм. Процесс полимеризации протекает в течение 15 мин. Стеклянные пластины разъединяют и освобохсдают образовавшую пластину полиакриламидного геля. Из пластины геля штампуют круглые диски диаметром 70 мм. Полученные диски помещают в емкость и заливают 0,5%-ным водным раствором хлорис: того натрия из расчета 20 мл раствора на 1 диск.- Диски Далее вьщернивают в 0,5%г-ном водном растворе хлористого натрия в течение 12 ч, заменяя раствор через каждые 4 ч. По истечении 12 ч раствор сливают.

Полученные диски полиакриламидного геля содержат мае.%

Полиакриламид 11,0 0,5%-ный водный раствор хлористого натрия 89,0 Полученный полиакриламидный гель не токсичен, обладает высокой пористостью, гидрофильностью, эластичностью, прозрачностью, термостабильностью.

Клетки различных видов микроорганизмов, нанесенные на гель длительное (3 месяца и более) время, сохраняли форму, размеры и жизнеспособность, что свидетельствует об изоосмотичности данного геля с клетками микроорганизмов.

Гель хорошо насыщался субстратами для питания микроорганизмов, например мясо-пептонным бульоном, и поэтому он был использован в качестве плотной основы для получения питательных сред с целью культивирования различных групп микроорганизмов (эшерихии, сальмонеллы, шигеллы, протей, стафилококки и др.).

Для насыщения отмытые диски заливают бульоном Хоттингера с аминньом

азотом 300 мг % из расчета 10 мл бульона на 1 диск и стерилизуют паром под давлением при 30 мин За это время происходило (асыиение дисков бульоном и стерилизация. Насыщенные бульонои стерильные диски, соблюдая стерильность, помещают в стерильные чаыки Петри, подсуиивают и засевают кишечной палочкой. Микроорганизг.1ы подвергают инкубации при 37°С в течение суток. За это время на поверхности дисков вырастала культура кишечной палочки в виде колоний.

При росте на геле микроорганизмы сохраняли биологические свойства: характер роста и размножения, форму клеток и колоний, морфологические, тинкторисшьные, культуральные, биохимические, серологические свойства, антигенную структуру, фаголи-зобильность. При этом биомасса выросших микроорганизмов при одинаковой посевной дозе превышала биомассу тех же шкpoopгaнизмoв, выросших на мясо-пептонном агаре.

5

Определялась выживаемость исследованных видов микроорганизмов на полиакриламидноп геле в соответствии с изобретением и на известном геле (2)1

0 Результаты сведены в таблицу.

Staphy1OCOCCUS Пример 2. Полиакриламидный гель, содержащий, мас.%: полиакриламид 8,0, физиологический раствор , получают способом, описанным в.примере 1. В качестве физиоло- 65 гического раствора используют 0,9%ный водный раствор хлористого натрия. Полученный полиакриламидный гель не был токсичен, обладал высокой по

ристостью, гидрофильностью, эластичностью, прозрачностью, термостабильностыо.

Гель хорошо насыщался субстратами для питания микроорганизмов, клеток животных и человека. . .

Нанесенная на поверхность геля 2%-ная суспензия эритроцитов барана (0,2 мл) не подвергалась гемолизу, а нанесенные фибробласты, клетки HEI и KB, сохраняли форму, размеры и жизнеспособность в течение до 2 сут при . Внутрйбркшинная и mлaнтaция белым пластин полученного геля размерами 1 смх1 смхо,3 см в течение 5 сут не изменяла первоначальны2 ; размеров пластин. Пластины оставались прозрачными, не вызывали реактивных изменений со стороны окружающих органов и тканей, хорошо переносились животными даже при одномомептной имплантации одному животному 2-3 пластин,

Пример 3. Полиакриламидный гель в соответствии с изобретением содержащий , мае . % : полиакриламид 0,3физиологический раствор 97,0, получают способом, описанным в примере 1. В качестве физиологического раствора используют раствор РингераЛока,

Свойства полученного полиакриламидного геля аналогичны свойствам, описанным в 2.

Кроме того, на данном геле форма, размеры и жизнеспособность фибробластов, клеток ИЕI а и КБ сохранялись до 4 сут при .

Пример 4. Полиакриламидный гель, в соответствии с изобретением, содержащий, мае.%: полиакриламид 1,0 физиологический раствор 89,0, получают способом, описанныгл в примере 1 В качестве физиологического раствора используют раствор Хэнкса,

Свойства полученного полиакрилами ного геля были сходны свойствам, опи санным в примере 3.

Кроме этого, пластины геля были окрашены в розовой цвет, а форма, размеры и жизнеспособность фиброблас тов, клеток Не а и КБ сохранял1 сь до 6 сут при .

Полученные пластины геля насыщают средой роста для культур клеток,, содержащей 60% среды 199, 20% гидролизата лактальбумина, 20% сыворотки крупного рогатого скота и :используют для выращивания клеток Hela, При этом клетки Hela вырастали на поверхности геля в виде типичного монослоя в обычные сроки,

Пример 5. Полиакриламидный гель, содержащий мас.%: полиакриламид 20,0, физиологический раствор 80,0, получают способом, списанным в примере 1. В качестве физиологического раствора используют раствор Эрла.

Свойства полученного полиакриламидного геля были аналогичны свойствам, описанным в примерах 2 и 4.

Пример 6. Полиакрилаглидный гель, содержащий мас.%: полиакриламид 5,0, физиологический раствор 95, получали способом, описанным в примере 1.

В качестве физиологического раствора используют среду 199.

Свойства полученного полиакриламидного геля были сходны со свойствами, описанными в примерах 2 и 4.

Кроме того, форма, размеры и жизнеспособность фибробластов, клеток Hela и КБ сохранялись до 3-10 су при 4° С.

Выросшие на пластинах геля клетки были хорошо прикреплены к гелю, что позволило переносить вырезанные из пластин блоки геля с клетками и исследовать под микроскопом, а также заключать блоки с клетками в микрокамеры..

Пример 7. Полиакриламидный гель, содержащий, мае.%: полиакриламид 15,0, физиологический раствор 85,0, -получают способом, описанным в примере 1.

Б качестве физиологического раствора используют среду 199.

Свойства полученного полиакриламидного геля были сходны со свойствами, описанными в примерах 2 и 4, Кроме того, выросший на пластинах геля монослой клеток легко смывался, что позволило легко накапливать биомассу клеток.

Пример 8. Полиакриламидный гель, содержащий, мае.%: полиакриламид 7,0, физиологический раствор 93,0, получают способом, описанным с примере 1.

В качестве физиологического раствора используют среду Игла.

Свойства полученного полиакриламидного геля были сходны со свойствами, описанными в примерах 2 и 7.

Кроме того, пластины геля, насыщенные средой роста, были использованы для выращивания клеточных штаммов При этом наблюдали хороший рост диплоидных клеток.

Пример 9. Полиакриламидный гель, содержащий Mac.%t полиакриламид 10,0, физиологический раствор 90,0, Получали способом, описанным в примере 1. В качестве физиологического раствора используют 5%-ный раствор глюкозы.

Свойства полученного полиакриламидного геля были сходны со свойствами, описанными в примере 2.

Кроме того, на данном геле форма, размеры и жизнеспособность фибробластой, клеток Но la и КП сохранялись до 3 сут при 4С. Наряду с этим но данном геле было отмечено ускорение роста и увеличение биомассы микроорганизмов, содержащих сахаролитические ферменты. Отсутствие в составе геля хлористого натрия значительно упростило определение количества хлористого натрия в клетках микроорганизмов. Пример 10 (сравнительный). Готовят полиакриламидный гель, содержащий , мае.%: полиакриламид 2,0, физиологический раствор 98,0. В качестве физиологического раствора используют 0,5%-ный водный раствор хлористого натрия. При этом полученный полиакриламидяый гель имел полужидкую консистенцию, не позволяющую получать пластины геля, осуществлять их отмывку и насыщение субстратами для питания микроорганизмов, клеток хсивотных и человека, посевы микроорганизмов и клеток. После добавления жидких питательных субстратов гель растворялся в них и терял гелевую структуру. Пример 11 (сравнительный). Готовят полиакриламидный гель, содер жащий, мае.%: полиакриламид 29,0, физиологический раствор 71,0. В качестве физиологического раствора используют О ,9%-ный водный раствор хлористого натрия.При этом получен ный полиакриламидный гель имел очень плотную консистенцию и был ломок при изгибах. Отмывка пластин геля от исходных компонентов была малоэф фективной, требовала длительного вр мени - 15 и более суток. Гель плохо насыщался субстратами для питания микроорганизмов и культу клеток, быстро высыхал с появлением трещин при и плохо фиксировался в чашках Петри. Таким образом, использование изо ретения позволит получать полиакрил идные гели .с улучшенными эксплуатаионньлпи характеристиками и расгииить область их применения в медицие и биологии. Формула изобретения 1. Полиакриламидный гель для меико-биологических целей, включающий етчатый сополимер акриламида.с N,N-метилен-бис-акрилс1мидом и среду набухания, отличающийся тем, что, с целью расширения функциональных возможностей геля и улучшения его эксплуатационных характеристик, в качестве среды набухания он содержит физиологический раствор, при следующем соотношении компонентов, мас.%: Сетчатый сополимер 3,0-28,0 Физиологический раствор72,0-97,0 2. Способ получения полиакриламидного геля для медико-биологических целей путем радикальной сополимеризации акриламида с N,N-метилеи-бис-акриламидоп в присутствии инициатора и активатора радикальной полимеризации с последующей отнывкой геля от низкомолекулярных примесей, отличающийся тем, что сополинеризацию и отмывку геля осуществляют в физиологическом растворе при следующей исходной концентрации мономеров, мас.%: АкриЛамида 0,5-40 N.N-метилен-бис2,5-12 -акриламида Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Патент СШЛ № 3046201, кл. 195-100, 19G2. 2.Авторское свидетельство СССР № 659619, кл. С 12 к 1/06, 1972 (прототип).