Способ определения антигена Советский патент 1985 года по МПК A61K39/00 

.

9д 1 Изобретение относится к иммуноло гии и касается способа определения антигена. Ивестен способ определения антигена в биологической жидкости с помощью реакции преципитации в лунках ij, Известен также способ определени антигена в биологической жидкости путем электрофоретического разделени исследуемой жидкости в колонке с гелем с последующим введением антисыворотки в лунки по сторонам геля, инкубированием реакционной системы и учетом результатов по наличию полос преципитации 2J . Однако известные способы не обе печивают высокой точности определения. . Целью изобретения является повышение точности определения. Эта цель достигается тем, что со ласно способу определения антигена в биологической жидкости путем элек рофоретического разделения исследуе мой жидкости в колонке с гелем с последующим введением антисыворотки инкубированием реакционной системы и учетом результатов по наличию полос преципитации, разделение иссле/дуемой жидкости проводят в наружном ;слое геля, затем в геле формируют канал и антисыворотку вводят в этот канал. Пример 1i Разделительные камеры для диск-электрофореза (стеклянные трубочки) герметизируют с нижнего конца, установив их вертикально в подставке для полимериза ции. Затем берут стеклянный капилляр, на 10-20 мм длиннее раздели гельной камеры, диаметром 1-2 мм. Герметизируют один из кондов капилляра, за тем его вводят внутрьразделительно камеры герметизированным концом вверх, не доводя его до конца камеры на 5-10 мм. Капилляр и разделительная камера располагаются соосно Капилляр укрепляют в этом положении оставляя открытым отверстие разделительной камеры, через которое вве ден капилляр. Разделительн5 ю камеру заполняют растворами сомономеров, из кбторых полимеризуется акриламидный гель. После полимеризации геля разделител ную камеру укрепляют в приборе для вертикального электрофореза, в нее 512 вносят исследуемую биологическую жидкость, которую наслаивают на поверхность гелевой колонки по капилляру, прибор заполняют буферными растворами, подводят напряжение и проводят разделение исследуемой биологической жидкости. После проведения разделения, гель извлекают из разделительной камеры для проведения реакции иммунодиффузии. Для этого разгерметизируют конец капилляра и извлекают его. В сформированный канал вводят антисыворотку. Гель в вертикальном положении оставляют на 12-24 ч для осуществления иммунодиффузии и затем внутри геля выявляют четкие линии преципитации, соответствующие фрак.циям антигена. Для идентификации линий преципитации и более четкого их выявления гелевые колонки можно окрасить специфическими красителями. Пример 2. Для ускорения реакции иммунодиффузии канал в. колонке полиакриламидного геля после проведения диск-электрофореза заполняют агаром с иммунной сывороткой, колонку помещают в буферный раствор для электрофореза, например трисглицериновый буфер рН 8,6, через который пропускают перпендикулярно гелевой колонке электрический ток силой до 60-90 мА. Время диффузии сокращается до 30 мин. Агар с иммунной сывороткой готовят следунщим образом. Агар варят в .буферном растворе до получения прозрачной однородной массы. Применяют 1,5%-ный гель агара. В остуженный до 50 С агар добавляют 1-10%- иммунной сыворотки, тщательно перемешивают и заливают канал. Вместо агарового геля для заливки канала можно применять полиакриламидный гель, введя в его состав антисыворотку. Пример 3. Вьювление локализации иммуноглобулинов сыворотки крови, специфичнык к растворимым мембранным белкам клеток печени. Путем гомогенизации ткани печени с последуклцим центрифугированием галогената получают фракцию растворимых мембранных белков ткани печени. Затем определяют их титр в рациальной иммунодиффузии по Манчини.

J 1

Для этого готовят 10 порций 1%-ного агарового геля и вносят в него выделенную фракцию белков в разведении 1:100-1:10. После полимеризации геля в Нём формируют лунки, диаметр которых равен диаметру канала в полиакриламидной гелевой колонке (пример 1). В каждую лунку вносят по 0,05 мл сыворотки крови обследуемых больных и инкубируют до момента окончания иммунодиффузии, при этом титр фракции мембранньрс белков выбирают таким, чтобы в реакции радиг1льной иммунодиффузии диаметр кольца преципитата не превьшал диаметр колонки полиакриламидного геля

Монтируют устройство для электро фореза в геле, разделяют образцы сывороток крови объемом по 0,05 мл и формируют канал в геле по примеру 1. После этого в канал гелевой колонки вносят фракцию растворимых мембранньк белков в необходимом титре и инкубируют колонки до появления полос преципитации.

Гелевые колонки с зонами преципи тации подвергают денситометрированию. При этом, по предлагаемому способу на денситомограмме зона локализации искомых иммуноглобулинов

460514

характеризуется одногорбным пиком, основание которого идентично длине фракции искомого иммуноглобулина, а высота пика пропорциональна его

5 концентрации. При определении антигена по известному способу с последующей денситометрией преципитата характер кривой двугорбый, так как прямой сканирующий луч света при

10 денситометрии пересекает дугу пре,ципитации дважды, поэтому двугорбая кривая не отражает точной локализации искомого антигена в геле и не харак теризует его концентрацию.

(5 При сравнительной оценке точности предлагаемого и известного cnoco-f бов и на примере десяти образцов сы- вороток крови больных выявлено что по предлагаемому способу точная локализация искомого белка определяет ся в десяти случаях, тогда как по : известному способу точное определение локализации белка получено в шести, удовлетворительное в двух и

2S неудовлетворительное в двух случаях Использование предлагаемого способа позволяет повысить точность определения антигена, что в свою очередь позволяет повысить качество диагностики заболеваний.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА в биологической жидкости путем элект.рофоретического разделения исследуемой жидкости в колонке с гелем с последующим введением антисыворотки, инкубированием реакционной системы и учетом результатов по наличию полос преципитации, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, разделение исследуемой жидкости проводят в наружном слое геля, затем в геле формируют канал и антисыворотку вводят в этот канал.