Способ определения скорости лизисафибРиНОВОгО СгуСТКА Советский патент 1981 года по МПК G01N33/86 

Химотрипсий растворяют в 0,1 и. фосфатном буфере рВ 7,4.

Концентрация 0,25 мг/мя. Начальную оптичеЬкую плотность замеряют на спектрофотометре при длине волны 280 нм.

Получение фибринового сгустка. Перед внесением растворов фибриногена и тромбина в трубку, нижний срез которой затянут сеткой, последнюю с внешней стороны затягивают пленкой

О,5 МП раствора фибриногена и 0,1 мл раствора тромбина вносят последовательно на сетку при помощи дозирукяцнх микропипеток, быстро перемешивают тонкой стеклянной пилочкой и полученную массу вьвдерживают при комнатной температуре в течение 1ч. Затем с сетки удаляют пленку и трубк с образовавшимся сгустком помещают в стаканчик с 20 мг раствора фермента на глубину 2-5 мм. Раствор фермеита перемешивают при помсяци магнитной мешалки со скоростью 150 об/мин. За скоростью лизиса фибринового сгустка следят по изменению (увеличению) оптической плотности при длине волны 280 нм во времени.

При проведении эксперимента берут два параллельных образца с тромбами и одну контрольную пробу.

Контрольная проба - изменение оптической плотности раствора фермента без фибринового сгустка, так как у раствора фермента в результате автолиза со временем происходит изменение оптической плотности.

При проведении эксперимента заполняют таблицу, строят график приращения оптической плотности от времени и определяют tg ot,

В таблице приведены изменения оптической плотности в зависимости от времени.

За .100% принимают оптическую плотйость при полном растворениисгустка Фиксируемое при этом время, это время полного растворения сгустка и оно служит величиной сравнения между образцами.

По данньол таблицы строят график приведенный на чертеже.

По оси абсцисс отложено время мин, at по оси ординат-приращение птической плотности в % при длине олны 280 нм. tg ciL определяют построением графика и уточняют методом наименьших квадратов. Примеру1 соответствует прямая 1 на чертеже, tg угла наклона прямой равен 0,60..

Пример 2. Этот пример прр§одях в тех же условиях, что и приfcp 1, однако концентрация фибриногена Ё сгустке 7 мг/мл. Концентрации химотрипсина та же, что и в примере 1 и составляет 0,25 мг/мл. Примеру соответствует линия 2 на чертеже, где tg угла наклона равен 0,74.

Пример 3. Условия те же, что и в примере 1. Концентрация фибриногена в сгустке 7 мг/мл. Концентрация химотрипсина 0,125 мг/мл. Примеру соответствует прямая 3 с tg угла наклона 0,44.

Пример 4. Условия и концентрация реагентов те же, что и в приглере 1. Опыт проводят через месяц послё проведения примера 1. Примеру также соответствует прямая 1с tg угла наклона 0,61. ., Из приведенного графика видно, iTo- tg угла наклона прямой характеризует скорость растворения фибринового сгустка, причем с увеличением скорости увеличивается tg угла наклона.

С увеличением концентрации фибриногена плотность фибринового сгуста возрастает, скорость растворения уменьшается, а следовательно, уменьшается tg угла наклона прямой.

С увеличением концентрации фермента,лизирующего сгусток,скорость лизиса увеличивается.

Предлагаемый способ быстро и с большой точностью позволяет определить скорость лизиса фибринового сгустка, а в известном способе для получения результата необходимо 10-20 опытов.

0,481 0,487 0,487 0,488

О 5

12 24

Способ определения скорости лизиса фибринового сгустка путем инкубации его с раствором фибринолитического фермента с последующим измерением оптической плотности инкубационной среды, отличающийс я тем, Что, с целью повышения точности способа, фибриновый сгусток перед инкубацией помещают на прониПродолжение таблицы

располагают на поверхности раствора фермента и процесс инкубации ведут при постоянном равномерном перемешив ании раствора.

Источники информации,

принятые во внимание при экспертизе If Caffney P.S. and Whitaher A.lf

Thrombosis Res, 1979, vol.14,

p. 85-94.

k

т