Способ определения плазминогена в эуглобулиновой фракции крови Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

4ib

00

а о ч

&э

Изобретение относится к медицине, а именно к области коагулологии, изучающей гемостаз и фибринолиз.

Целью изобретения является повы- шение специфичности и точности способа.

На фиг. 1 показан график изменения светопропус сания при 500 им в процессе образования и последующего лизиса фибринового сгустка (где слева направо представлены кривью хода реакхщи, полуг1енные при добавлении 50, 40, 30, 20 и 10 мкл эуглобулино- вой фракции стаидарТной плазмы, скорость лизиса фибрина (uT%/4t мин) .: определяли по тангенсу угла наклона ; Прямолинейного участка)| на фиг. 2 -; калибровочньгй график для опр:ед;еления I содержания пяазмкногена по скорости : лизиса фибрина (зависимость описыва--.; ;ется уравйенИ бм У -Зу2&- 0)Э2 где; . 0.,99); на фиг. 3 - график ерав- ; |Нения, результатов опр,еделЁ1ШЯ содер-. ;жания плазииногеда амидолитическим ;(ось, ординат) и предпагаекгым (ось : абе1Щ:сеа) методами (зависимость опи-; ;сьгоаетея уравнени ем Y 22,,68 f-0-j76X., ;Г2 0,91) ,

Способ оеущеетвляю г следующим об- разом,

Из цнтратйой плазмы осаждают эуглй :булинову.ю фракизню. Затем вносят её- в : к1овету. спектрофотэивтра, содергкащую С та-нда-ртньй раствор фибриногена сво- бедного от плазмяногена, PeaKipw за-- пускают доба-влеиием емеск. тромбина со стрептокиназой, стабйяизировднной бычьим сывороточным альбумином, и :регист| из5у1от изменения светопропус- кания н-ри 500 нм, п-ройсходящее .при об разовании я последунлцем лиз-исе фибри - нового сгустка. Скорость лизиса, оп- ределяемая по линейному у шстку кри- вой, отражающей процесс.лизиса сгуст ка, .прямо пропорциональна количеству, плазми-ногена в пробе (фиг, 1). Опреде лив скорость лизиса, находят соответ- ствующее значение содержания плазминО гена по калибровочному графику, построенному с использованием зуглобули новой фракции стандартней плазмы.

В предгртагаемом способе количество плазминогена определяетсй по активное ти образунлцегося плазмина, а не ком- 1гшекса стрептокиназа - плазминоген., j Оптимальное количество стрептокиназы;, необходимое для активации плазмино- гена в предлагаемом методе, находит

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ся в пределах 15-25 Е на 0,05 мп эуглобулиновой фракции. При добавле-- НИИ больших количеств стрептокиназы скорость лизиса фибрина уменьшается. График зависимости скорости лизиса от количества добавленной эуглобулиновой фракции стандартной плазмы (фиг. 2) пересекается с осью абсцисс в точке, соответствующей 5 мкл зугло- булиновой фракции ставдартной плазмы. Из этого следует, о при, добавлении 20 Е стрептокиназы 1-6% гшазминогена : ставдартной гшазмы уходит на образование активаторного кo fflлeкca. При : добавлетши избытка стрептокиназы боль- количест-зо стрептокиназы утсодит на обрсязование активаторного комплек- еа и, соответетвеино, меньшее количе-г етво прешращаетея в плазмин. Скорость лизиса уменьшается. Использование меньшик количеств стрептоиназы нежелательно, так как в крови обычно присутствуют антитела к белкам стрептококков, которые могут нейтрализовать некоторое количество стренктокиназы.

Дня выполнения первого определе-- ния требуется 1 ч 30 мин на получение эуглобуликовой фракгщи и Ю-З О мин - на п-остаиевку реакции. Бремя протека- 1-1ИЯ реакьщи .завиент от еодержания : плазминогена в пробе, Ири 100% реакция завершается за 5 мин, а при содержании плазминогена 20% требуется - около 20 мин. Об.разцы плазт Яз можно . хранить ири -20 С в течение месяца. Эуглобулиновые фракции хранили при и использовали в течение суток.

И р и м е р 1, К 4 мл дистг-шли- рованной воды добавили 75 мкл 1%-ной уксусной кислоты и 0,25 мл исследуе-. мой плазмы. После инкубации в тече-. 1ние 20 при центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. Осадок растворили в 0,25 боратно-солевого раствора ( И Na.,,, 145 мМ NaCl), В кювету спектрофото- |метра внесли 400 мкл раствора фибри- ногена, растворенного в концентрации- 1,5 мг/мп в 0,15 М Трис-НС1 буфере - рН 7,2 и 50 мкл эуглобулИновой фрак-, цли плазмы. Инкубировали 5 мин при 37°С., затем добавляли 50 мкл смеси, содержащей на t мп 1,5 мг тромбина (Каунасе), 5 мг бычьего сывороточного альбумина (Sigma и 400 Е стрепто- киназы (Calbiochero), приготовленной на 0,15 М Трис-НСУ буфере, рН 7,2. Черйэ 30 с после добавления смеси

включали регистрацию изменений свето- пропускания.

После завершения реакции определяли тангенс угла наклона .кривой, отражающей процесс лизиса фибрина. Содержание плазминогена в пробе определяли по калибровочному графику (фиг. 2). При низком содержании плазиспользовании известного способа в этом случае (таблица).

С целью сравнения точности был приготовлен раствор плазминогена с концентрацией белка 0,1 мг/мл и проведено 10 п-араллельных определений по предлагаемому и известному способам. Причем в двух последних определениях

Изобретеш- е относится к гемато- логнн. Цель изобретения - повышение специфичности и точности способа. В i Кювету спектрофотометра вносят раст- вор фибриногена и эуглобулиновую фракцию плазмы крови, инкубируют и добавляют тро.мбин, бьгчий сьшороточ- ньш альбумин и стрептокиназу. После добавле шя qмecи-регистрируют изменение светопропусканий. Затем определяют тангенс угла наклона кривой, отражающей процесс лизиса фибрина. По калибровочному графику рассчитьшают содержание плазминогена в пробе.3 ил. 1 табл. с

миногена в пробе ( 20%) для-повыше- ю к реакционной смеси добавили фибри- ния точности определения целесообраз- ноген до конечной концентрации tмг/мп. но использовать 100 мкл эуглобулино- вой фракции и 350 мкл раствора фиб- риногена, а содержание плазминогена,

15

определенное из графика (фиг. 2), разделить на 2.

На фиг. 3 представлены данные 30 определений содержания плазмнногена, вьшолненных по известному способу с использованием фромогенного субстрата Berichrom Р1 фирмы Behringwerke (ордината) и по предлагаемому спосо- бу (абсцисса). Использовали кровь доноров и больных, не страдающих тромбозами (содержание плазминогена 75%) и кровь батьных после лечения стрептокиназой (плазминоген 70%). Применение метода линейной регрессии для анализа данных показало, что зависимость между величинами, получен- ньми этими двумя способами, описыва-, ется уравнением прямой Y 0,76Х + + 22,68, коэффихщент корреляции г 0,91. Пересечение прямой с осью ординат в точке, соответствующей .22,68, хорошо согласуется с данными о завышении истинного содержания плазминогена при определении его по амидолитической активности при неЭтим моделируют одно из патологических состояний, когда известньй способ дает завышенные величины.

Из данных таблицы следует точность предлагаемого и известного способов приме рно одинакова при параллельных , измерениях судного и того же образца. Но амидолитическая активность ком-

20 плакса стрептокиназа-пла зминоген существенно потенциируется фибриногеном (пробы 9 и 10), что приводит к появлению систематической ошибки в определении по известноьгу способу,

25 Если сравнивать данные всех 10-ти определений, можно говорить о повышении .точности при использовании предлагаемого способа, которое обусловлено устранением систематической ошибки.

30

Формула и.3 обретения

Способ определения плазминогена в эуглобулиновой фракции крови, вклю- 05 чающий активацию его стрептокиназой, добавление в пробу лизируемого субстрата с последующей регистрацией скорости лизиса по изменению светопро- пускания и расчетом по калибровочнокоторых патологиях. Разница в 10-20% 40 МУ графику, о.я личающийся становится особенно выраженной притем, что, с целью повышения спёцифичнизкой концентрации плазминогена, обусловленной потреблением этого белка в ходе фибринолитической терапии. Кроме того, повьш енная концентрация продуктов деградации фибриногена, .как результат активации фибринолиза, создает еще один источник ошибок прк-,

к реакционной смеси добавили фибри- ноген до конечной концентрации tмг/мп.

Этим моделируют одно из патологических состояний, когда известньй способ дает завышенные величины.

Из данных таблицы следует точность предлагаемого и известного способов приме рно одинакова при параллельных , измерениях судного и того же образца. Но амидолитическая активность ком-

плакса стрептокиназа-пла зминоген существенно потенциируется фибриногеном (пробы 9 и 10), что приводит к появлению систематической ошибки в определении по известноьгу способу,

Если сравнивать данные всех 10-ти определений, можно говорить о повышении .точности при использовании предлагаемого способа, которое обусловлено устранением систематической ошибки.

30

Формула и.3 обретения

Способ определения плазминогена в эуглобулиновой фракции крови, вклю- 05 чающий активацию его стрептокиназой, добавление в пробу лизируемого субстрата с последующей регистрацией скорости лизиса по изменению светопро- пускания и расчетом по калибровочноности и точности способа, в качестве субстрата используют избыток фибрину, а стрептокиназу добавляют в количе- 45 стве, обеспечивающем выход кривой лизиса на линейньй участок с изменения - ми не менее 2,5% светопропускания в минуту.

Soi. 4-5

т

15

20 60 80 100 т т 160%

Шг,2

lOMKfl SyZHO yMHOM

фракции

15 HUH

U8.1

О 25 50 75 100 125 %

Раг.З

Составитель А.Агуреев Редактор А.Шандор Техред М.ДидыкКорректор М.Васильева

Заказ 5643/46

Тираж 847

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное