СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МОЧИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки фибринолитических свойств мочи при урологических, нефрологических заболеваниях, а также при тромбоваскулитах с поражением почек.

В основе фибринолитической активности мочи (ФАМ) лежит ферментативная цепь реакций, реализующихся через урокиназу, плазминоген, плазмин и тканевую систему ингибиторов и активаторов. Роль урокиназы заключается в активации плазминогена, который, превращаясь в плазмин, растворяет постоянно образующиеся в физиологических условиях, при урологических операциях и гематурии сгустки фибрина в почках и мочевых путях. Снижение ФАМ является предрасполагающим фактором к образованию фибриновой матрицы с последующей инкрустацией солями и возникновением конкремента. Вместе с этим высокая ФАМ может способствовать повышенной кровоточивости при попадании мочи на раневую поверхность при урологических операциях и усиливать гематурию при заболеваниях почек.

Известен способ определения ФАМ /Astrup T.S., Mullrtz S./ Arch. Biophem. and Biophys., 1952.- V 40.- N 2.- P. 345-351/, заключающийся в том, что застывшая на чашке Петри фибринная пленка лизируется под воздействием урокиназы мочи. Активность фермента определяется по площади лизиса за 2 часа. Для этого в две чашки Петри наливают приготовленный раствор фибриногена и раствор тромбина той концентрации, которая вызвала свертывание плазмы здорового человека в течение 12-15 сек. Нанесенные растворы тщательно перемешивают зигзагообразными движениями и оставляют на строго горизонтальной поверхности на 1 час. Затем одну чашку помещают в сушильный шкаф на 20 минут (t =90-95^oС) для инактивации плазминогена. Подщелоченную мочу вносят из микропипетки по одной капле в обе чашки Петри. Последние накрывают и помещают в термостат при 37^oC на 24 часа. По истечении времени определяют диаметр ясной зоны лизиса. В непрогретой чашке (опыт) почти всегда происходит лизис фибринной пленки, а в прогретой (контроль) - очень редко. Степень и площадь лизиса находятся в прямой зависимости от активности урокиназы. Последнюю определяют по площади лизиса, которую рассчитывают по формуле S = π• (D•D1)/4, где π = 3.14, D и D1 - диаметры лизиса. Значение урокиназы выражается в мм. кв. на 24 часа и составляет разницу между величиной площади лизиса на непрогретой и прогретой чашках Петри.

Его недостатками является недостаточная информативность и сложность: значительные ошибки в измерении площади лизиса из-за незначительных различий оптических плотностей между лизированной и интактной зоной, а также из-за нарушения горизонтального положения пластин; невозможность определения ингибиторов ФАМ; требуется титрование такого нестойкого реактива, как раствор тромбина; трудность изготовления фибриновых пластин.

Наиболее близким к заявляемому (прототип) является способ определения ФАМ с использованием хромогенного субстрата азофибрина /Монастырский В.А., Гайда А. В. и др. //Лаб. дело. - 1988. -N 10. - C. 49-53/, заключающийся в том, что при инкубации плазминогена с мочой, содержащей урокиназу, происходит его переход в активный плазмин, который способен расщеплять нерастворимый азофибрин с освобождением и переходом в раствор окрашенных пептидов, концентрация которых определяется фотометрически и пропорциональна активности плазмина.

В состав набора входит азофибрин, плазминоген, концентрированный фосфатный буфер. Для работы необходимы следующие материалы, реактивы и оборудование: 5 M раствор NaOH, дистиллированная вода, вата, шприцы на 5-10 мл, термостатирующая водяная баня на 37^oC , центрифуга, спектрофотометр или ФЭК, торсионные весы с погрешностью не более 0.1 мг, стеклянные пробирки. Подготовка к работе состоит из нескольких этапов:
1. Выполняется разведение концентрированного буферного раствора и тщательное перемешивание на магнитной мешалке.

2. Приготовление рабочего раствора плазминогена. Он может храниться не более 3 часов при комнатной температуре.

3. Подготовка мочи. При наличии видимых осадков ее центрифугируют.

4. Подготовка навесок азофибрина. Его развешивают по 10 мг в 25 пробирок. Хранится длительное время в сухом помещении.

5. Подготовка шприцов. Их набивают ватой однородной толщины 0.5 см. Затем в 2 пробирки (1 - испытуемая, 2 - контрольная) с азофибрином добавляют рабочий буферный раствор, затем плазминоген, после чего в 1 вносят испытуемую мочу. Пробы инкубируют 1 час на водяной бане при 37^oC. После инкубации в обе пробирки добавляют дистиллированную воду, интенсивно перемешивают и фильтруют путем продавливания через шприц. К фильтратам добавляют раствор NaOH, после чего раствор мгновенно окрашивается от оранжевого до красного. Параллельно для исследуемой мочи готовят 1 контрольную пробу, прибавляя к моче дистиллированную воду и раствор NaOH. Оптическую плотность фотометрируют против дистиллированной воды на спектрофотометре при 440 нм или ФЭК-М с синим светофильтром при длине оптического пути 1 см.

Урокиназную активность рассчитывают в % по формуле: УК (E1-Eк)•K, где E1 - оптическая плотность в 1 (испытуемой) пробирке; E2 - сумма поглощений в контрольных пробирках на азофибрин и мочу; K - расчетный коэффициент, который выводится для каждой серии наборов при исследовании пула мочи 20 здоровых доноров.

Недостатки метода: сложность, многоэтапность, плохая воспроизводимость в связи с указанным коэффициентом пересчета (K); неточность взвешивания азофибрина, снижение активности компонентов набора в результате несоблюдения условий хранения.

Положительным результатом заявляемого способа является повышение информативности, простота исполнения и расширение диагностических возможностей (способ позволяет прогнозировать течение и исход заболевания, предупреждать рецидивы заболевания, объяснить причину повышенной кровоточивости). По результатам исследования ФАМ заявляемым способом можно проводить корригирующую терапию.

Положительный результат достигается тем, что дополнительно используют цельную кровь и мочу больного как физиологическую модель, одновременно определяют фибринолитическую активность крови (суммарную и неферментативную) и общую ФАМ (суммарную и неферментативную) и по разнице судят об истинной урокиназной ее активности.

Способ осуществляется следующим образом. Готовят 5 пробирок, в пробирки 1 и 2 набирают по 0.1 мл 0.85%-ного раствора NaCI, в пробирки 3 и 4 по 0.1 мл 6%-ного раствора E-АКК (для блокады плазмина), в пробирку 5 - 4 мл 0.04%-ного раствора аммиака. Кровь берут у больного натощак из локтевой вены в сухую пробирку без консерванта в количестве 1 мл и немедленно разливают в заранее приготовленные пробирки с растворами: в пробирки 1, 2, 3 и 4 по 0,2 мл, в пробирку 5 - 0.02 мл. Затем после образования сгустков в пробирки 2 и 4 добавляется по 0,5 мл свежей мочи. В пробирках 1 и 2, содержащих физиологический раствор NaCI, определяется суммарная фибринолитическая активность крови - СФА (1-я пробирка) и суммарная фибринолитическая активность мочи - СФАМ (2-я пробирка). В пробирках 3 и 4, содержащих Б-АКК, определяют неферментативную фибринолитическую активность крови-НФА (3-я пробирка) и неферментативную фибринолитическую активность мочи-НФАМ (4-я пробирка). Пробы 1, 2, 3 и 4 инкубируют при 37^oC в термостате (ТС-80) 3 часа, после чего в 1-ую и 3-ю пробирки приливают по 0,5 мл физиологического раствора NaCI. Сгустки отмывают стеклянной палочкой и ею же удаляются из пробирок 1, 2, 3 и 4. К оставшейся после удаления сгустков сыворотке крови, окрашенной гемоглобином из эритроцитов, выделившемся при лизисе кровяного сгустка, добавляют по 3.5 мл 0,04 %-ного раствора аммиака. Далее измеряют оптическую плотность жидкостей из пробирок 1, 2, 3 и 4 против раствора 5 на ФЭК при зеленом светофильтре.

Расчет фибринолитической активности крови (ФАК) производят по разнице оптической плотности растворов в 2 кюветах по формулам;

Расчет ФАМ производят аналогично:


Урокиназную активность мочи (УАМ) рассчитывают по формуле:
УАМ, в % = СФАМ-НФАМ
КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИМЕРЫ
1. Больной М. , 8 лет. История болезни N 875. Диагноз: Острый гломерулонефрит, нефротическая синдром. ПН 0.

Результаты исследования предлагаемым способом:
больной - норма
СФА - 8.6% - СФА - 28.4%
НФА - 5.1% - НФА - 16,5%
СФАМ - 22.7% - СФАМ- 56.8%
НФАМ - 9.6% - НФАМ- 31.2%
УАМ - 13.1% - УАМ - 25.6%
Таким образом, с помощью предлагаемого способа выявлено снижение фибринолитической активности мочи, что приводит к замедлению лизиса фибрина, который закономерно откладывается в почечных клубочках и приводит к нефросклерозу.

2. Больной Б. , 12 лет. История болезни N 2203. Диагноз: Мочекаменная болезнь (камень левой почки). Рецидив. Поступил в хирургическое отделение с клиникой почечной колики. Год назад был прооперирован по поводу камня левой почки. При доведении ультразвукового исследования почек был вновь выявлен конкремент в левой почке.

Результаты исследования фибринолитической активности:
больной - норма
СФА -10,6 % - СФА - 28,4%
НФА - 3,3 % - НФА - 16,5%
СФАМ - 7,3 % - СФАМ - 56,8%
НФАМ - 7,3 % - НФАМ - 31,2%
УАМ - 0% - УАМ - 25,6%
В результате проведенного исследования выявлено снижение как общей, так и урокиназной активности мочи, что является предрасполагающим фактором для дальнейшего камнеобразования и требует терапии, направленной на повышение фибринолитической активности мочи, что позволит предупредить рецидивирование мочекаменной болезни.

3. Больная П., 14 лет. История болезни N 171. Диагноз: Геморрагический васкулит, смешанная форма, почечный синдром. На 7 день болезни появились изменения в общем анализе мочи в виде гематурии, предлагаемым способом исследована фибринолитическая активность
больная - норма
СФА - 70% - СФА - 28,4%
НФА - 55% - НФА - 16,5%
СФАМ - 85% - СФАМ - 56,8%
НФАМ - 43% - НФАМ - 31,2%
УАМ - 42% - УАМ - 25,6%
По лабораторным данным выявлена высокая фибринолитическая активность крови и мочи, последняя способствовала повышенной кровоточивости с развитием гематурии.

Способ может быть использован в медицине и биохимии для определения фибринолитической активности мочи (ФАМ). Исследуемую мочу инкубируют при 37°С, в качестве субстрата используют сгусток собственной крови больного, инкубируют его с мочой, затем отделяют сгусток крови, а в оставшейся жидкости определяют ФАМ путем измерения оптической плотности. Способ информативен и прост в исполнении.

Способ определения фибринолитической активности мочи (ФАМ) путем ее инкубации при 37^oC и измерения оптической плотности, отличающийся тем, что в качестве субстрата фибринолиза используют сгусток собственной крови больного, инкубируют его с мочой, затем отделяют сгусток крови, а в оставшейся жидкости определяют ФАМ путем измерения оптической плотности.