Способ исследования свертывания крови Советский патент 1992 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к медицинской биохимии и может быть использовано в клинико-лабораторной практике в качестве теста для

заболеваний,

системы.

ДИЭГНОС1ИКИ

связанных с

и лечения патологией

Для объективного исследования заболеваний системы гемостаза осуществляют тестирование несколькими способами, определяя основные параметры свертывания и фиб- ринолиза, например: скорость свертывания, содержание фибриногена в плазме и время лизиса сгустка.

Известны в клинико-лабораторной практике следующие способы определения:

-количественное определение содержания фибриногена в плазме крови путем введения в нее смеси монойодуксусной кислоты с фосфатным буфером, инкубирования с тромбином, содержащим ионы кальция, растворение отмытого сгустка в 1,5%-ной уксусной кислоте в соотношении к плазме (20-25): 1, общее время - около 40-50 мин,

-определение времени лизиса сгустка в разведенной (1:10) крови без коагулянта в течение 7-8 ч,

-определение времени лизиса эуглобу- линового сгустка с добавлением во фракцию тромбина и раствора хлористого кальция при температуре 37°С, общее время 3-4 ч в норме,

-определение времени эуглобулиново- го лизиса на фибриновых пластинах, общее время 18-24 ч,

-определение времени лизиса эуглобу- линового сгустка при введении во фракцию стрептокиназы.

Из числа известных аналогов прототипом заявляемого способа является способ определения времени лизиса эуглобулино- вого сгустка, который включает осуществление следующих операций:

-получение эуглобулиновой фракции путем введения 0,016% уксусной кислоты в плазму, выдерживание в течение 20 мин, в холодильнике, центрифугирование, отделение и высушивание осадка,

-введение фосфатного буфера, тщательное перемешивание,

-добавление смеси стрептокиназы (фирма Стрептаза, Швейцария и 0,277% раствора хлористого кальция при легком покачивании;

-после образования сгустка следят с помощью секундомера за временем лизиса, норма которого составляет 10±0,5 мин.

Общая продолжительность способа - 40-60 мин.

Однако все известные способы обладают существенными недостатками: они требуют значительного времени и определяют только один параметр сложной системы гемостаза, причем, в основном, визуально полуколичественно.

Целью изобретения является ускорение и упрощение сюсоба.

Цель достигается тем, что в способе определения параметров свертывания и фиб- ринолиза крови, включающем последовательное введение коагулянта и

стрептокиназы во фракцию крови, перемешивание смеси определение параметров путем регистрации изменения светорассеяния, о качестве сырья используют плазму, разбавленную в вероналовом буфере в соотношении 1:(10-80), в которую вводят коагулянт тромбин в соотношении к стрептокиназе (1,25-2,5):(1-25) при рН 7,4, ионной силе 0,1-0,15 и температуре 22- 37°С и регистрируют спектрофотометрически изменения светорассеяния при 350 нм, определяя скорость и время свертывания плазмы, концентра цию фибриногена, скорость фибринолиза время полулизиса и полного лизиса фибри

нового сгустка

Благодаря указанному диапазону соотношений тромбина к стрептокиназе (1,25- 2,5):(1-25), определенным показаниям, характеризующим кислотно-щелочное состояние, ионную силу температуру, достигается сначала свертывание фибриногена под действием тромбина, а затем лизис ф ибри- нового сгустка под действием стрептокиназы во вре мени, достаточном для

одновременного спектрофотометрического определения шести параметров свертывания и фибринолиза на одном образце плазмы.

Общая продолжительность способа - не

более 10 мин в норме, что значительно меньше времени, которое затрачивают при осуществлении известных аналогов.

На фиг,1 представлена стандартная кривая изменения светорассеяния при

свертывании и лизисе фибрина в разбавленной плазме крови; на фиг.2 - калибровочная кривая для определения концентрации фиб- риногеиа в донорской плазме по максимальному светорассеянию.

Левая часть кривой на фиг.1 характеризует процесс свертывания фибриногена, сопровождающийся увеличением поглощения вплоть, до максимального значения (Емакс.- Ш). Эта величина прямо пропорциональна

концентрации свертываемого фибриногена плазмы, что позволяет определить его точную концентрацию по калибровочной кривой, приведенной на фиг.2. Скорость увеличения светорассеяния, определяемая

по тангенсу угла наклона касательной, проведенной к точке максимального увеличения светорассеяния (tg а на фиг.1), характеризует скорость образования фибрина в плазме (1). Такая характеристика общепринята при изучении полимеризации фибрина.

Время достижения максимального светорассеяния (ti) представляет собой время свертывания плазмы (11). После этого, как весь фибриноген плазмы превратится в фибрин и формируется сгусток, начинается его лизис под действием стрептокиназы, сопровождающийся уменьшением светорассеяния до исходного уровня. Скорость уменьшения светорассеяния (tg /3) характеризует скорость фибринолиза (IV). Время, за которое максимальное светорассеяние уменьшается в 2 раза (ti/2) представляет собой время полулизиса сгустка (V), а время, за которое ЕЗБО возвращается к исходному нулевому уровню (t2) - время полного лизиса - (VI). Эти параметры (время полулизиса и время полного лизиса сгустка) характеризуют фибринолитический потенциал плаз- мы и используются для оценки фибринолитической активности (7). Уменьшение времени полулизиса/лизиса сгустка свидетельствует об ускорении, а увеличение - об угнетении фибринолиза. Определе- ние оптимальных условий способа, заявленных в формуле изобретения, проводят эксперимейтально. При концентрации тромбина до 1,0 N1H ед/мл скорость свертывания растет, а затем остается постоян- ной. Скорость и время лизиса не зависят от концентрации тромбина в диапазоне 0-5 N1H ед/мл.

При увеличении концентрации стрептокиназы до 0-25 ед/мл параметры свертыва- ния не изменяются, в то время как скорость лизиса растет, а время лизиса уменьшается в интервале концентрации стрептокиназы 0-4 ед/мл, а затем эти параметры не меняются в пределах от 4-25 ед/мл,

Оптимальными концентрациями тромбина и стрептокиназы для обеспечения высокойвоспроизводимостиистандартизации являются концентрации тромбина (1,25-2,5) N1H ед/мл и стреп- токинагы 1-25 ед/мл,

Степень разбавления плазмы веронало- вым буфером лимитируется чувствительностью спектрофотометра (СФ-46).

Влияние содержания фибриногена в плазме .на параметры свертывания и фиб- ринолиэа изучают следующим образом: к 0,1 мл донорской плазмы с известным содержанием фибриногена добавляют возрастающие количества фибриногена или используют различные разбавления плазмы. Тромбин (2,5 М1Н/мл) вводят при постоянном количестве стрептокиназы (1 или 5 ед/мл). Как видно, на фиг.2 увеличение концентрации фибриногена сопровождается возрастанием величины Емакс (I И), причем зависимость ее от концентрации фибриногена носит линейный характер. Увеличение количества вносимой в пробу плазмы в 2 раза также приводит к 2-кратному увеличению Емакс, поэтому для построения калибровочной кривой можно использовать различные разведения донорской плазмы. Полученная линейная корреляция Емакс. и концентрации фибриногена дает возможность быстро определять концентрацию фибриногена в плазме.

Все исследования следует проводить в определенном диапазоне температур 22- 37°С. Понижение температуры снижает скорость свертывания и фибринолиза.

Для ускорения этих процессов при температуре 22°С следует увеличить количество стрептокиназы (пример 5). Повышение ионной силы выше 0,15 тормозит свертывание фиб риногена плазмы, а при понижении ионной силы менее 0,1 увеличивается Емакс. светорассеяния.

Способ проводят при строгом соблюдении физиологического значения рН - 7,4,т.к. при подкислении среды до рН 5,4 скорость свертывания (tg 2-1) уменьшается в 3 раза, скорость фибринолиза (tg Д-IV) - в 2 раза. При подщелачивании до рН 8,0 увеличивается активность плазмина, что вызывает быструю деградацию фибриногена.

Пример 1. В термостатированную кювету спектрофотометра с автоматической регистрацией светорассеяния (А 350 нм) вносят последовательно 0,1 мл бедной тромбоцитами цитратной плазмы крови человека (здорового донора), 1,84 мл 0,02 М вероналового буфера, содержащего 0,13 М NaC и 0,001 М CaCIa, т.е. соотношение плазмы к вероналовому буферу 1:20 (при рН 7.4 ионной силе 0,15) 0,01 мл раствора стрептокиназы (1000 ед/мл) до конечной концентра ции 5 ед/мл и 0,05 мл раствора тромбина (100 N1H ед/мл) до конечной концентрации 2,5 N1Н ед/мл в том же буфере. Смесь тщательно перемешивают, фотометрируют при температуре 37°С и проводят анализ кривой изменения светорассеяния, полученной с помощью самописца (фиг. 1) для определения времени свертывания (ti, мин.), скорости свертывания фибриногена (tga), величины максимального светорассеяния (Емакс), по которой .находят концентрацию фибриногена в плазме (фиг.2), скорость фибринолиза (tg Д), время полулизиса (ti/2, мин) и время полного лизиса (т.2, мин) фибриново- го сгустка. Результаты расчета приведены в табл.1,

Примеры 2-5.

Все операции, проводимые с донорской плазмой, регистрацию светорассеяния и определение шести параметров свертывания и фибринолиза осуществляют согласно описанию примера 1.

Условия, режимы и результаты для каждого примера представлены в табл.1,

Пример 6.

Все операции, проводимые с плазмой крови больного гастроэнтероколитом (ГЭК), регистрацию светорассеяния, а затем определение шести параметров свертывания и фибрииолиза осуществляют согласно описанию примера 1.

Условия, режимы и результаты представлены в табл,1

Пример 7.

Все операции, проводимые с плазмой крови больного ишемической болезнью сердца (ИБС) перед операцией (артериокоро- нарное шунтирование), регистрацию светорассеяния и определение шести параметров свертывания и фибринолиза осуществляют согласно описанию примера 1.

Условия, режимы и результаты представлены в табл,1,

Доказательство точности нового способа проводят по двум схемам сравнения,

1. Сопоставляют результаты определения параметров свертывания и фибринолиза на плазме 10 здоровых доноров при постоянной t 37°C, ионной силе 0,15 рН 7,4 разбавлении плазмы о вероналовом буфере 1:20, концентрации тромбина 2,5 N1H ед/мл, стрептокиназы 5 ед/мл.

Результаты, представленные в ,2, покасыпают тождественность параметров.

И, Сопоставляют результаты определения чОицентрацш. фибриногена по новому способуиспособу-анало у. Новый мет од позволяет получить те же самые результаты в пределах ошибки сравниваемых методов,

Способ по точности не ус, упает известным аналогам.

Полученные результаты по способу полностью совпадают с результатами общепринятых коагулологических методов оценки состояния (емосгаэа, в частности, определение времени свертывания количества тромбоцитов, содержания продуктов расщепления фибриногена (фибрина-ПРФ) и растворимых комплексов фибрина - РКФ

антитромбина III, протромбинового индекса.

Преимущества нового способа в сравнении с известными аналогами заключают- ся в следующем:

-сокращение времени до 10 мин в отличие от известных способов: 40-60 мин или 3-24 ч,

-многоаспектность диагностических исследований за счет расширения диапазона определяемых параметров: вместо одного параметра одновременно определяют 6 параметров свертывания и фибринолиза

-упрощение методологических при- емов за счет исключения сложного получения эуглобулиновой фракции;

-условия и схема проведения нового способа позволяют осуществить компьютеризацию процесса диагностических исследований плазмы крови.

Формула изобретения

Способ исследования свертывания крови, включающий определение показателей свертывающей и фибринолитической систем крови, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, в кювету спектрофотометра вводят бедную

тромбоцитами плазму и вероналсвый буфер в соотношении V/V1:10-80 при ионной силе 0,1 -0,15 рН - 7,4, затем добавляют растворы сгрептокиназы и тромбина в соотношении (,,5):(1-15) и регистрируют кинзтику

светорассеяния при 350 нм, а показатели систем крови рэссчитывают из характеристик полученной кривой соответствующих калибровочных кривых, приэтом о соде ржании фибриногена судят по максимальному

светорассеянию, о скорости свертывания фибриногена - по тангенсу угла, образуемого касательной к точке максимального увеличения светорассеяния, о времени свертывания фибриногена - по времени достижения максимального светорассеяния, о

скорости фибринолиза - по тангенсу угла

наклона касательной к точке максимального

уменьшения светорассеяния, а о времени

полулпзиса и полного лизиса - соответстпенно по времени уменьшения максимальное светорассеяния в два раза и по времени возвращения светорассеяния к исходному уровню.

Пример 1 (донорскаяплазма) 0,15

Пример 2 (донорскаяплазма) 0,15

Пример 3 (донорскаяплазма) 0,15

Пример 4 (донорскаяплазма) 0,15

Пример 5 (донорскаяплазма) 0,1

Пример 6

(плазма

больного

ГЭК)0,15

Пример 7

(плазма

больного

ИБС)0,15

7,4370,11:201,02,50,51 2,8 0,020/0,7 0,062k

7,4370,11:205,02,5111,25 0,082/2,7 4,23,04,0

7,4370,2 1:10 5,02,5241,1 0,164/5,4 4,43,34,3

7,4370,025 1:60 5,02,50,8 2,3 0,020/0,7 0,574,55,2

7,4370,11:20 1,02,55,6 1,9 0,082/2,7 1,73,77,0

7,4220,11:20 251,254,3 2,0 0,082/2,7 2,04,05,1

60

1 370,11:20 5,02,5281,2 0,232/6,6 6,22,83,3

Таблица2

Использование: медицинская биохимия, клинико-лабораторная практика, тест для диагностики и лечения заболеваний, связанных с патологией системы гемостаза, Целью изобретения является ускорение и упрощение способа. Сущность изобретения: в плазму, разбавленную вероналовым буфером в соотношении 1:(10-80), вводят коагулянт тромбин в соотношении к сгреп- токиназе (1.25-2,5):(1-25) при рН 7,4, ионной силе 0,1-0,15, температуре 22-37°С и регистрируют спектрофотометрически изменения светорассеивания при 350 нм, определяя скорость и время свертывания плазмы, концентрацию фибриногена, скорость фибринолиза, время полулизиса и полного лизиса фибринового сгустка по полученному спектру. Фиг. 2, табл. 3. сл с XI XJ VI о 00 ю

Таблица 3

Определение концентрации фибриногена в плазме крови человека

0.1

0.05

макс

345

Время, мин. Фиг.1