Способ получения тромбоконцентрата Советский патент 1981 года по МПК A61K35/14 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОКОНЦЕНТРАТА

: .

Изобретение относится к медицине, -а именно гематологии и касается получения препаратов из крови для лечения нарушений гемостаза.

Известен способ получения тромбокон-, центрата путем смешивания с антнагрёгатом и центрифугирования {.

Однако известный способ позволяет получить тромбоконцентрат с повышенной адгезивно-агрегационной активностью тромбоцитов.

Цель изобретения - снижение адгезивиоагрегационной активности тромбоцитов.

Указанная цель . достигается тем, что способ получения тромбоконцентрата осуществляют путем смешивания сырья с антиагрегантом и центрифугирования, кровь или обогашенную тромбоцитами плазму смешивают с тетрациклином гидрохлоридом в конечной концентрации 100-300 мкМ.

Способ осуществляют следующим образом.

Кровь или обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) перед центрифугированием обрабатывают тетрациклином гидрохлоридом в конечной концентрации 100 - 300 мкМ

В течение 0,5- I ч. 150 мг кристаллического тетрациклина гидрохлОрида растворяют в 50 мл физиологического раствора, а затем к полученному раствору добавляют еще 50 мл 1/15 М раствора Na«HPO. Раствор тетрациклина гидрохлорида концентрации 1,5 мг/мл, рН 7,2 добавляют в пластикатные мешки с цельной кровью или ОТП, добиваясь конечной концентрации тетрациклииа от 0,07 до 0,2 мг/мл (100 - 300 мкМ). Время преннкубации тромбоцитов с тетрациклином до начала центрифугировання составляет от 30 мин до 1 ч. Центрифугирование производят при обычном режиме. Осажденные тромбоциты не размазываются по стенкам мешка, не слипаются между собой и легко ресуспендируются в оставшейся плазме. Оставляя малые объемы плазмы, можно получать очень высокие концентрации тромбоцитов (например, Ю кл/мл). Выход клеток составляет 75 - . Способ позволяет готовить тромббконцектраты из крови, хранившейся в холодильнике до 6-ти сут. Г1ри этом выход клеток составляет 50-100 /о от количества, содержащегося в ОТП, а зависимости от срока хранения крови и применяемой концентрации тетрациклина.

Пример 1. 250 мл свежей крови, заготовленной на растворе ЦГф, центрифугируют 10 мин при 200 g: К 100 мл ОТП (350000 кл/мм) добавляют 16 мл pacfBopa тетрациклина гидрохлорида. .Конечная концен рация тетрациклина равняется,0,20 мг/Нй,или 300 мкМ. После 40-минутной инкубации при комнатной температуре тромбоциты осаждают центрифугированием при 1200 g в течение 8 мин. Для сравнения из той же крови готовят контрольный тромбоконцентрат по обычной методике, при тех же режимах центрифугирования, но без применения тетрациклина. Выход клеток составляет с тетрациклином 80%, а без него 60%. Для исследования агрегации, реакции на гипотонический шок и ретракции сгустка оба тромбоконцентрата разбавляют аутологичной плазмой, не содержащей тетрациклина, до концентрации 350000 кл/мм и инкубируют в течение I ч при 37°С.

Агрегация тромбоцитов, индуцированная различными концентрациями АДФ и арахидоновой кислотой (свежая кровь) приведена в табл. 1.

Ретракция сгустка после ресуспеидирования выделенных с помощью тетрациклина тромбоцитов сохраняется полностью. Реакция на гипотонический шок снижается на 20 - 30%. Процедура приготовления тромбоконцентратов с помощью тетрациклина не влияет на количество малонового диальдегида, образующегося под действием тромбина (1 ед/мл), а также на ПОЛ (перекисное окисление липидов), индуцированное

АДФ

2ОО мкМ

АДФ

2 мкМ

Ада

2 мкМ

Арахидоновая

к-га 16О мкМ

Fe. Исследование формы тромбоцитов пос-. ле их выделения в присутствии тетрациклина и последующего ресуспендирования методом фазовоконтрастной микроскопии показало, что клетки остаются, в основном, дисковидными.

Пример 2. Кровь, заготовленная на консерванте ЦОЛИПК 76, хранится во флаконах при 4°С в течение 5 сут. .Надосадочную ОТП (450000 кл/мм) отсасывают водо-струйным насосом, переводят в пластикат-, ный мешок и добавляют тетрациклин гидрохлорид в конечной концентрации 0,07 мг/м (100 мкМ). Инкубируют 1 ч, центрифугируют при 1200 g в течение 8 мин, удаляют есклеточную плазму и ресуспендируют клеткиг в аутологичной плазме, не содержащей тетрациклина до концентрации 420000 мл/мм/ Выход тромбоцитов составляет 60%.

Агрегация тромбоцитов, индуцированная различными концентрациями АДФ (кровь, хранившаяся при 4°С в течение 5 сут) приведена в табл. 2.

Ретрация сгустка до и после осаждения тромбоцитов составляет 80%. Реакция на гипотонический шок в обоих случаях отсутствует. ПОЛ, индуцированное тромбином и Fe не изменяется форма тромбоцитов, согласно оценке методом фазовоконтрастноймикроскопии, в обоих случаях сферическая.

Предлагаемый способ позволяет значительно снизить адгезивно-агрегационную активность тромбоцитов, увеличить выход клеток и улучшить их качество.

Таблиц

77

43

10

7О

Формула изобретения

. Способ получения тромбоконцентрата путем смешивания сырья с антиагрегантом и центрифугирования, отличающийся тем, что с целью снижения адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов, кровь или обогащенную тромбоцитами плазму смешивают

Таблица 2

с тетрациклином гидрохлоридом в конечной концентрации 100 - 300 мкМ

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Becker G. А. et а1. Prosta landin Е-1 in preparation and of fJlatelet concentrates.-«Science, 1972, 175, p 538539.