Способ получения цитокинов из тромбоцитов пуповинной крови как субстрата для разработки лекарственных средств для человека и животных Российский патент 2019 года по МПК A61K35/19 

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к биологически активным веществам, катализирующим регенеративные процессы, и способам их производства.

Цитокины - это гидрофильные сигнальные вещества, действие которых опосредовано специфическими рецепторами на внешней стороне плазматической мембраны. Главными цитокинами, катализирующими регенеративные процессы, являются: трансформирующий фактор роста β (TGF-β), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF-I, IGF-II), фактор роста фибробластов (FGF), эпидермальный фактор роста, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста эндотелиальных клеток. Эти цитокины играют важную роль в процессах клеточной пролиферации, хемотаксиса, дифференциации и ангиогенезаю.

В настоящее время следующие области медицины активно внедряют использование цитокинов как стимулятор ренаративных процессов:

1) Спортивная медицина - лечение переломов, травм, растяжений, регенерация хрящевой ткани и сухожилий, исследования показывают, скорость регенерации может быть увеличена на 20-50% при применении плазмы, обогащенной тромбоцитами. А это значит сокращение времени реабилитации и возвращение к активной жизни.

2) Хирургия/пластическая хирургия - восстановление врожденных дефектов костной ткани, восстановление больших костных дефектов после ДТП, несчастных случаев. В настоящий момент очень перспективно использование цитокинов в составе имплантатов для замещения костной ткани, что значительно ускоряет приживление имплантатов, снижает риск их отторжения. Использование цитокинов совместно с имплантатами позволяет

достигать полного восстановления больших костных дефектов, уменьшая сроки восстановления.

3) Хирургия/комбустиология - лечение ожогов, восстановление больших участков повреждений, лечение поверхностных и глубоких трофических язв. Использование цитокинов плазмы в составе заменителей кожи или в составе фибринового клея на трофические язвы увеличивает скорость регенерации на 50% и более процентов. Даже в тех случаях, когда трофические язвы не заживают при использовании классических методов лечения, что характерно при сахарном диабете, использование цитокинов, доказано уменьшает объемы язвы и в большинстве случаев полностью их закрывают, что, в конечном счете, позволяет избежать осложнений и дальнейшей ампутации.

4) Стоматология - лечение пародонтозов/пародонтитом и костных дефектов. Применение цитокинов плазмы позволяет улучшать остеоинтеграцию имплантатов, способствует рекрутированию остеобластов, тем самым стимулируя формирование здоровой костной ткани.

Для получения терапевтической концентрации цитокинов из тромбоцитов необходимо провести выделение и концентрирование тромбоцитов. Согласно литературным данным, необходимое количество цитокинов для клинически значимого эффекта можно получить только при концентрировании тромбоцитов на уровне 1 миллион тромбоцитов на микролитр растворителя. Разработка такого препарата включает в себя следующие этапы: 1. Выделение и очистка тромбоцитарной фракции; 2. отработка процедур деструкции тромбоцитов для выделения цитокинов с определением цитокинового профиля.

Известна также композиция «Compositions comprising placental stem cells and platelet rich plasma, and methods of use thereof. WO 2012092458 A2 Номер заявки PCT7US2011/06778, в которой описывается возможность применения плазмы, обогащенной тромбоцитами совместно со стволовыми клетками для применения в регенеративной медицине. Изобретение

относится к определению правильной композиции (соотношения) и использования клеток и PRP.

Известен также способ «Process for the preparation of serum and platelet growth factors extract» WO 1995015763 A1 Номер заявки PCT/CA1994/000601, дата публикации Июнь 15, 1995, который отработан только на свиньях, для концентрирования тромбоцитов используются режимы центрифугирования от 1000g до 3000g, а для активации используются метод обработки ультразвуком, и последующей экстракцией с помощью ацетона.

Известный способ обладает следующими недостатками - это технология, которая предполагает ее использование только в месте, где есть пациент и только его материалом. Таким образом, это ограничивает его применение. Активация ультразвуком и протокол выделения дает низкую эффективность и высокую вариабельность результатов.

Наиболее близким к заявляемому изобретению (прототипом) является «Process for the preparation of platelet growth factors extract. US 5834418 A Номер заявки US 08/618,560, дата публикации Ноябрь 10, 1998, в котором:

a. используют кровь свиней. Т.е. ксеногенный материал;

b. протокол получения тромбоцитов варьируется от 4 до 7 ступеней центрифугирования со скоростью 1000-5000 g:

c. тромбоциты отмываются специальным раствором Plasma-Lyte А;

d. высокий разброс конечной концентрации тромбоцитов от 100000 до 10000000000 тромбоцитов/мкл.

Недостатком указанного способа является высокая трудозатратность и цена метода (много дорогого оборудования, дополнительные материалы), низкая повторяемость и эффективность метода, невозможность применения у людей.

Задачей изобретения является разработка экономичного способа получения цитокинов из тромбоцитов пуповинной крови, как субстрата для разработки лекарственных средств для человека и животных.

Поставленная задача решается предлагаемым способом получения цитокинов из тромбоцитов пуповинной крови, как субстрата для разработки лекарственных средств для человека и животных, содержащий три этапа: на первом этапе производят забор пуповинной крови у разных доноров, вводят в каждый пакет с донорской кровью раствор Стабизол в объеме 20% от объема крови пакета, центрифугируют каждый из пакетов с кровью в режиме плавного изменения программы, в результате чего кровь разделяется на обогащенную тромбоцитами плазму и эритроциты, указанная программа состоит из следующих режимов: разгон до 540 RCF в течение 5 мин; разгон до 900 RCF в течение 2 мин; торможение до 300 RCF и вращение в течение 2 мин; торможение до 100 RCF и вращение в течение 1,3 мин с последующим отключением центрифуги, затем из пакетов удаляют эритроциты и утилизируют их; на втором этапе проводят объединение всех донорских пакетов ОТП и концентрирование всех тромбоцитов, для чего полученную обогащенную тромбоцитами плазму переносят в соответствующее количество пробирок типа фалькон, объемом 50 мл, проводят центрифугирование для концентрирования тромбоцитов в режиме 15 минут на скорости 4000 g, в результате центрифугирования получают концентрат тромбоцитов и обедненную плазму, обедненную плазму убирают для использования в качестве растворителя, оставляя 5 мл плазмы на дне пробирок, полученные тромбоцитарные концентраты разных доноров объединяют в одной пробирке объемом 50 мл и разводят обедненной плазмой до объема 50 мл, или в качестве растворителя используют физиологический раствор, если в дальнейшем требуется исключить белки плазмы; полученный пул тромбоконцентрата повторно центрифугируют в режиме 60 минут' на скорости 50 g для удаления остатков эритроцитов и лейкоцитов, после центрифугирования надосадочную жидкость в объеме 45-48 мл переносят в новую пробирку объемом 50 мл, а 1 мл раствора отправляют в лабораторию для подсчета тромбоцитов на автоматизированном гематологическом анализаторе, на третьем этапе полученный тромбоконцентрат с известным количеством тромбоцитов на мл или мкл подвергают процедуре хранения/активации, при этом фалькон с тромбоконцентратом опускают в криохранилище сухого типа на 15 минут при температуре -196 градусов Цельсия, замороженный продукт помещают на хранение в морозильную камеру при температуре -80 градусов Цельсия, где хранят до 3-х лет, причем дальнейшую активацию продукта проводят перед непосредственным использованием путем быстрого размораживания, для этого фалькон помещают в водяную баню с температурой +37 градусов Цельсия до полного оттаивания продукта, а при необходимости получить продукт с концентрацией цитокинов/тромбоцитов менее, чем в замороженном: продукте, конечный продукт разводят в соответствующее количество раз, при этом используют исходную концентрацию тромбоцитов.

В заявляемом способе предлагается использовать донорский материал в качестве субстрата для получения цитокинов. Использование в качестве источника тромбоцитов/цитокинов пуповинной крови - значительно снижает себестоимость получения конечного продукта (при сравнении цен на лечебную дозу тромбоконцентрата и стоимости получения образца пуповинной крови для нужд банка ПК). Преимуществами такого препарата является наличие коктейля цитокинов естественного происхождения, со значительным сроком хранения, готового для применения «но запросу».

В настоящее время для получения обогащенной цитокинами плазмы разработано множество методов. Существуют методы, основанные на использовании иммунных реакций, для выделения и очистки тромбоцитов. Такие методики обладают хорошей эффективностью, но как правило, требуют дополнительного оборудования и реагентов, кроме того соответствующие наборы, разрешенные к применению на территории РФ, отсутствуют. Самые распространенные методы выделения тромбоцитов, основаны на разнице в размерах и весе клеточных элементов и для их разделения используются различные методики градиентного центрифугирования. Большинство методик предназначенных для получения

тромбоцитов рассчитаны на использование в трансфузиологии, в связи с этим наличие других клеток в препарате не является критичным. В случае, когда тромбоциты необходимы как субстрат цитокинов, в процессе получения которых происходит разрушение всех клеточных элементов, наличие других клеток (эритроциты и лейкоциты) будут обременять конечный продукт ненужными примесями (клеточные мембраны, белок, ДНК, РНК, гемоглобин, продукты жизнедеятельности клеток и т.д.). Поэтому стандартные методы центрифугирования не обеспечат должного уровня очистки будущего препарата, В связи с этими обстоятельствами предложено использовать методы выделения тромбоцитов с существенными изменениями по сравнению с известными.

Вторым этапом получения цитокинов стала отработка процедуры высвобождения цитокинов из тромбоцитов. Согласно имеющимся данным литературы, существуют два наиболее распространенных метода выделения цитокинов из тромбоцитов химический и физический. Химический метод представляет процесс, аналогичный процессу, проходящему в организме, когда тромбоциты попадают в место повреждения. В качестве активатора освобождения альфа гранул тромбоцитов используется тромбин и Са+.

Являясь наиболее физиологичным методом - он несет в себе некоторые недостатки, такие как цена и наличие высоких доз Са+ в конечном продукте, что ограничивает применение его в культуральных целях. Альтернативой химическому методу служит - физический, который заключается в применении последовательных процедур быстрого замораживания и оттаивания без применения криопротекторов. Этот метод прост, не требует наличия оборудования или дополнительных реагентов, однако в разных источниках литературы приводится разная информация о количествах циклов замораживания/оттаивания без предоставления информации об изменении количества цитокинов. Наличие такой информации необходимо для сокращения рабочего времени и издержек производства, а также по

данным литературы излишние циклы замораживания могут привести к разрушению цитокинов.

Следующим этапом проводится очистка конечного продукта от фибринобразуюших агентов и долгосрочное хранение продукта при отрицательных температурах.

Способ получения цитокинов из тромбоцитов пуповинной крови, как субстрата для разработки лекарственных средств для человека и животных реализуется следующим образом.

Предлагаемый способ позволяет приготовить терапевтически пригодный коктейль цитокинов для его дальнейшего применения в качестве субстрата для изготовления лекарственных препаратов и косметических средств.

Задачей способа является получение конечного продукта с концентрацией тромбоцитов не менее 1 миллиона на микролитр и остаточной концентрацией лейкоцитов и эритроцитов близкой к 0.

Ввиду того, что объем пуповинной крови одного человека ограничен (40-80 мл) в предлагаемый способ включено пулирование (объединение) образцов разных доноров. Для повышения эффективности удаления эритроцитов, в пакет с кровью добавляют раствор Стабизола в объеме 20% от объема крови пакета. Способ реализуется в три этапа:

I. Первый этап (получение обогащенной тромбоцитами плазмы):

На первом этапе производят забор пуповинной крови у разных доноров, вводят в каждый пакет с донорской кровью раствор Стабизол в объеме 20% от объема крови пакета, центрифугируют каждый из пакетов с кровью в режиме плавного изменения программы, в результате чего кровь разделяется на обогащенную тромбоцитами плазму и эритроциты, указанная программа состоит из следующих режимов: разгон до 540 RCF в течение 5 мин; разгон до 900 RCF в течение 2 мин; торможение до 300 RCF и вращение в течение 2 мин; торможение до 100 RCF и вращение в течение 1,3 мин с последующим

отключением центрифуги, затем из пакетов удаляют эритроциты и утилизируют их.

II. Второй этап (Объединение образцов и концентрация)

На втором этапе проводят объединение всех донорских пакетов ОТП и концентрирование всех тромбоцитов, для чего полученную обогащенную тромбоцитами плазму переносят в соответствующее количество пробирок типа фалькон, объемом 50 мл, проводят центрифугирование для концентрирования тромбоцитов в режиме 15 минут на скорости 4000 g, в результате центрифугирования получают концентрат тромбоцитов и обедненную плазму, обедненную плазму убирают для использования в качестве растворителя, оставляя 5 мл плазмы на дне пробирок, полученные тромбоцитарные концентраты разных доноров объединяют в одной пробирке объемом 50 мл и разводят обедненной плазмой до объема 50 мл, или в качестве растворителя используют физиологический раствор, если в дальнейшем требуется исключить белки плазмы; полученный пул тромбоконцентрата повторно центрифугируют в режиме 60 минут на скорости 50 g для удаления остатков эритроцитов и лейкоцитов, после центрифугирования надосадочную жидкость в объеме 45-48 мл переносят в новую пробирку объемом 50 мл. а 1 мл раствора отправляют в лабораторию для подсчета тромбоцитов на автоматизированном гематологическом анализаторе.

III. Третий этап (активация и нормализация продукта)

На третьем этапе полученный тромбоконцентрат с известным количеством тромбоцитов на мл или мкл подвергают процедуре хранения/активации, при этом фалькон с тромбоконцентратом опускают в криохранилище сухого типа на 1 5 минут при температуре -196 градусов Цельсия, замороженный продукт помещают на хранение в морозильную камеру при температуре -80 градусов Цельсия, где хранят до 3-х лет, причем дальнейшую активацию продукта проводят перед

непосредственным использованием путем быстрого размораживания, для этого фалькон. помещают в водяную баню с температурой +37 градусов Цельсия до полного оттаивания продукта, а при необходимости получить продукт с концентрацией цитокинов/тромбоцитов менее, чем в замороженном продукте, конечный продукт разводят в соответствующее количество раз, при этом используют исходную концентрацию тромбоцитов.

Получаемый продукт содержит большое количество биологически активных цитокинов/химокинов, участвующих в регенеративных процессах. Применение цитокинового субстрата возможно для разработки лекарственных средств, добавок для культуральных сред при культивировании клеток. Непосредственно субстрат можно использовать в исходном виде для применения в косметологии и лечении алопеции.

Предлагаемый способ позволяет при готовить терапевтически пригодный коктейль цитокинов для его дальнейшего применения в качестве субстрата для изготовления лекарственных препаратов и косметических средств. Способ экономичен и позволяет производить продукт с концентрацией цитокинов до 1 млн/мкл. Предлагаемый способ имеет следующие преимущества перед PRP и другими известными технологиями/патентами:

- способ позволяет получить комплекс цитокинов из источника, обладающего большей концентрацией цитокинов - пуповинная кровь,

- цитокины пуповинной крови обладают значительно более высокой активностью с точки зрения регенерации, поэтому полученные цитокины можно использовать для создания стабильных рецептур и лекарственных препаратов, которые могут храниться и применяться без необходимости подготовки (применение off the shelf - «прямо с полки»):

- в связи с использованием другого источника цитокинов метод заготовки и выделения цитокинов кардинально изменен и отличен от аналогичных методов, что существенно удешевляет конечный продукт и увеличивает производительность.

Изобретение относится к медицине, и может быть использовано для получения цитокинов из тромбоцитов пуповинной крови. Способ включает три этапа: на первом этапе производят забор пуповинной крови у разных доноров, вводят в каждый пакет с донорской кровью раствор Стабизол в объеме 20% от объема крови пакета, центрифугируют каждый из пакетов с кровью в режиме плавного изменения программы, в результате чего кровь разделяется на обогащенную тромбоцитами плазму и эритроциты. Указанная программа состоит из следующих режимов: разгон до 540 RCF в течение 5 мин; разгон до 900 RCF в течение 2 мин; торможение до 300 RCF и вращение в течение 2 мин; торможение до 100 RCF и вращение в течение 1,3 мин с последующим отключением центрифуги, затем из пакетов удаляют эритроциты и утилизируют их. На втором этапе проводят объединение всех донорских пакетов ОТП и концентрирование всех тромбоцитов, для чего полученную обогащенную тромбоцитами плазму переносят в соответствующее количество пробирок типа фалькон объемом 50 мл, проводят центрифугирование для концентрирования тромбоцитов в режиме 15 минут на скорости 4000g, в результате центрифугирования получают концентрат тромбоцитов и обедненную плазму. Обедненную плазму убирают для использования в качестве растворителя, оставляя 5 мл плазмы на дне пробирок, полученные тромбоцитарные концентраты разных доноров объединяют в одной пробирке объемом 50 мл и разводят обедненной плазмой до объема 50 мл или в качестве растворителя используют физиологический раствор, если в дальнейшем требуется исключить белки плазмы; полученный пул тромбоконцентрата повторно центрифугируют в режиме 60 минут на скорости 50g для удаления остатков эритроцитов и лейкоцитов. После центрифугирования надосадочную жидкость в объеме 45-48 мл переносят в новую пробирку объемом 50 мл, а 1 мл раствора отправляют в лабораторию для подсчета тромбоцитов на автоматизированном гематологическом анализаторе. На третьем этапе полученный тромбоконцентрат с известным количеством тромбоцитов на мл или мкл подвергают процедуре хранения/активации, при этом фалькон с тромбоконцентратом опускают в криохранилище сухого типа на 15 минут при температуре -196 градусов Цельсия, замороженный продукт помешают на хранение в морозильную камеру при температуре -80 градусов Цельсия, где хранят до 3-х лет. Дальнейшую активацию продукта проводят перед непосредственным использованием путем быстрого размораживания, для этого фалькон помещают в водяную баню с температурой +37 градусов Цельсия до полного оттаивания продукта, а при необходимости получить продукт с концентрацией цитокинов/тромбоцитов менее, чем в замороженном продукте, конечный продукт разводят в соответствующее количество раз, при этом используют исходную концентрацию тромбоцитов. Предлагаемый способ позволяет приготовить коктейль цитокинов для его дальнейшего применения в качестве субстрата для изготовления лекарственных препаратов. Способ экономичен и позволяет производить продукт с концентрацией цитокинов до 1 млн/мкл.

Способ получения цитокинов из тромбоцитов пуповинной крови как субстрата для разработки лекарственных средств для человека и животных, содержащий три этапа: на первом этапе производят забор пуповинной крови у разных доноров, вводят в каждый пакет с донорской кровью раствор Стабизол в объеме 20% от объема крови пакета, центрифугируют каждый из пакетов с кровью в режиме плавного изменения программы, в результате чего кровь разделяется на обогащенную тромбоцитами плазму и эритроциты, указанная программа состоит из следующих режимов: разгон до 540 RCF в течение 5 мин; разгон до 900 RCF в течение 2 мин; торможение до 300 RCF и вращение в течение 2 мин; торможение до 100 RCF и вращение в течение 1,3 мин с последующим отключением центрифуги, затем из пакетов удаляют эритроциты и утилизируют их; на втором этапе проводят объединение всех донорских пакетов ОТП и концентрирование всех тромбоцитов, для чего полученную обогащенную тромбоцитами плазму переносят в соответствующее количество пробирок типа фалькон объемом 50 мл, проводят центрифугирование для концентрирования тромбоцитов в режиме 15 минут на скорости 4000g, в результате центрифугирования получают концентрат тромбоцитов и обедненную плазму, обедненную плазму убирают для использования в качестве растворителя, оставляя 5 мл плазмы на дне пробирок, полученные тромбоцитарные концентраты разных доноров объединяют в одной пробирке объемом 50 мл и разводят обедненной плазмой до объема 50 мл или в качестве растворителя используют физиологический раствор, если в дальнейшем требуется исключить белки плазмы; полученный пул тромбоконцентрата повторно центрифугируют в режиме 60 минут на скорости 50g для удаления остатков эритроцитов и лейкоцитов, после центрифугирования надосадочную жидкость в объеме 45-48 мл переносят в новую пробирку объемом 50 мл, а 1 мл раствора отправляют в лабораторию для подсчета тромбоцитов на автоматизированном гематологическом анализаторе, на третьем этапе полученный тромбоконцентрат с известным количеством тромбоцитов на мл или мкл подвергают процедуре хранения/активации, при этом фалькон с тромбоконцентратом опускают в криохранилище сухого типа на 15 минут при температуре -196 градусов Цельсия, замороженный продукт помешают на хранение в морозильную камеру при температуре -80 градусов Цельсия, где хранят до 3-х лет, причем дальнейшую активацию продукта проводят перед непосредственным использованием путем быстрого размораживания, для этого фалькон помещают в водяную баню с температурой +37 градусов Цельсия до полного оттаивания продукта, а при необходимости получить продукт с концентрацией цитокинов/тромбоцитов менее, чем в замороженном продукте, конечный продукт разводят в соответствующее количество раз, при этом используют исходную концентрацию тромбоцитов.