Способ определения патогенностиНЕйССЕРий Советский патент 1981 года по МПК C12N1/00 

1

Изобретение относится к медицинской микробиологии.

Известен способ определения пато генности нейссерий путем заражения куринньк эмбрионов с последующим инкубированием и определением жизнеспособности эмбриона

Однако известный способ недостаточно чувствителен.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа.,

Эта цель достигается тем, что определяют патогенность нейссерий путем заражения куриных эмбрионов с последующим инкубированием и определением жизнеспособности эмбриона, при этом эмбрион заражают-2 млрд. микробной взвеси нейссерий пр 0,1 мл на хорионаллартоисную оболочку и после инкубирования дополнительно определяют выраженность кровоизлияни .отек мозга и других органов, парезов конечностей, по которьт характеризуют -степень патогенности.

Способ осуществляют следующим образом.

Подготавливают куриные эмбрионы, дЛя зараженияберут 9-11-дневные куриные э мбрионы, у которых искусственно перемещают воздушный мешок для заражения через щель в скорлупе на хорионаллантоисную оболочку (ХАО).

Подготовка культуры нейссерий: 16-20 часовую культуру нейссерий с сывороточного агара смывают физиологическим раствором (рН 7,0-7,2) и готовят 2 млрд. микробную взвесь, соответствующую 20 ед. международного оптического стандарта мутности.

Для заражения куриных эмбрионов 2 млрд. взвесь нейссерий вводят на ХАО в объеме 0,1 мл таким образом, чтобы доза для одного эмбриона составила 200, млн. микробных тел. Этб оптимальная доза инокулята, вызывающая различные степени тяжести патологоанатомических изменений органов и тканей эмбрионов в зависимости oi

38

вирулентных свойств испытываемого штамма. Контрольной группе эмбрионов вводят по 0,1 мл стерильного физиоло гического раствора. Опытные и конт рольные группы эмбрионов инкубируют 20-24 ч в условиях периодически вентилируемой камеры термостата при 37-38°С.

Овоскопию проводят по общепринятой методике для определения жизнеспособности эмбрионов.

Определяют степень вирулентности исследуемого штамма нейссерий.

Яйцо вскрывают с соблюдением правил асептики, определяют жизнеспоСобность эмбриона по его подвижности и сравнивают с результатами овоскопии Затем стерильным шприцем отсасывают ликвор и кровь эмбриона для посева на сывороточный агар и приготовления маз ков Для повышения достоверности диагностики. После этого вскрывают брюшную и грудную полости, отсепаровьгеают кожу на голове эмбриона для обнажения мягкой мозговой оболочки.

Учитывают патологоан.атомическую картину изменения органов и тканей: наличие тромбоза сосудов ХАО, кожных и мозговых кровоизлияний, спастически сокращенных мышц конечностей, отек головного мозга, гиперемию и отек печени и почек.

Для подтверждения специфичности развивающегося процесса, кроме высево из ликвора и крови, можно сделать высевы из мозга,.печени, сердца и почек

Степени вирулентности исследуемого штамма нейссерий определяют при сравнении патологоанатомических изменеНИИ органов и тканей опытных и контрольных эмбрионов.

При вскрытии контрольные эмбрионы живые, с хорошо развитыми сосудами ХАО; кожные покровы и внутренние органы без особенностей. {

При вскрытии опытных эмбрионов, зараженных нейссериями, вявляется одна из четырех форм (степеней)изченени органов и тканей в зависимости от степени выраженности признаков - бессимптомная, легкая, средняя и тяжелая.

Бессимптомная форма. Опытные эмбрионы по внешнему виду и состоянию о рганов не отличаются от контрольных эмбрионов, хотя в высевах типируются нейссерий.

22А

Легкая форма. При вскрытии - живой эмбрион, сосуды ХАО без изменений, кожа светлая с единичными мелкоточечными кровоизлияниями, внутренние органы без изменений, однако на оболочках мозга единичные кровоизлияния.

Средняя форма. При вскрытии погибший эмбрион с тромбированными сосудами и капиллярами ХАО;- па фоне гиперемированной козки видна разно-, калиберная сыпь, отмечается отек головного мозга, Определяемый по выбуханию полушарий мозга и вытеканию красновато-желтой мутной жидкости при прокалывании кожи и оболочек мозга бактериологической петлей, инъекция капилляров и кровоизлияния на оболочках мозга. Выраженные изменения паренхиматозных органов; резкое увеличение в размерах, отек, гиперемия печени и почек. Сердце останавливается в систоле желудочков, предсердия заполнены темной кровью, просвечивающей через ткани сердца.

Тяжелая форма. Погибпшй эмбрион резко отличается от контрольных как по размерам, так и по внешнему виду. Увеличение размеров эмбриона связано с резким отеком тканей, головного мозга и внутренних органов. Кожарезко гиперемирована с цианотичным оттенком, кроме типичной сыпи отмечаются кровоизлияния по ходу крупных сосудов на шее и лапах. Типичные спастические сокращения конечностей (поджатые лапы со сведенными пальцами, не поддающимися разгибанию).

Высоковирулентными счтают штаммы, дающие гибель эмбрионов с развитием тяжелой степени поражений органов и тканей.

Умеренновирулентными - штаммы нейсерий, -вызывающие гибель эмбрионов и среднюю ст.епень их поражения.

Слабовирулентными - штаммы, вызывающие слабую степень поражения эмбрионов.

Авирулентными - штаммы, которые по результатам вскрытия, не зависимо от высева возбудителя и обнаружения его в мазках, не отличаются от контрольной группь эмбрионов.

Пример оценки степени патогенности нейссерий на куриных эмбрионах, при заражении эталонными штаммами. Непатогенный штамм , нейссерий N.Subflaba Непаторенный штамм нейссерий N.flaba Слабовирулейтный штамм менингококка I Высоковирулентный штамм менингококка № 1298. № 1409/1 Штамм менингококка: 16-20 часовые культуры вьипеперечисленных штаммов нейссерий смывают физиологическим раствором с сывороточного агара и готовят 2 млрд. взве (20 Ед. по международному оптическому стандарту) и в объеме 0,1 мл вводят ХАО 9-11-дневным куриным эмбр онам. .Контрольным эмбрионам аналогич ным методом вводят физиологический раствор. Через 24 часа инкубации при 37-38°С в термостате яйца овоскопируют и вскрывают. Сравнивают жизнеспособность эмбрионов, установленную при вскрытии яйца, с результатами ов скопии, делают высевы крови, ликвора органов и мазки из ликвора, крови, затем изучают степень патологоанатомических изменений органов и тканей эмбрионов. Результаты опытов. Контрольная группа эмбрионов. При вскрытии все эмбрионы живые с хорошо развитыми сосудами и капиллярами ХАО, которые заполнены светлой (артериальной) или(темной) венозной кровью. Кожные покровы и внутренние органы без особенностей. Штамм N.Subflaba 20 М. Овоскопия: все эмбрионы живые. Вскрытие эмбрионов: по внешнему виду и состоянию органов и тканей он не отличаются от контрольной группь. эмбрионов. В высевах из крови, ликво ра, внутренних органов и с оболочек Мозга - N. Subflaba. Заключение; штамм авирулентный. Штамм N. flaba 65. Овоскопияt: од эмбрион погиб, остальные живые. Вскрытие эмбрионов:/ а)живые эмбрионы по внешнему вид и состоянию органов не отличаются от контрольных эмбрионов, в высевах из тканей и жидкостей N.flaba. б)погибший плод - кожа светлая, негиперемированная, внутренние органы без особенностей, отсутствуют характерные признаки, наблюдаемые при заражении эмбрионов менингококковой культурой, такие, как полиморфные по 26 техии, кровоизлияния по ходу крупных сосудов, отек головного мозга, резкая гиперемия и отек паренхиматозных органов. Таким образом, у одного эмбриона неспецифическая гибель, а остальные не отличаются от контрольных эмбрионов. Заключение: штамм вирулентный. Штамм менингококка М-20. Овоскопия: все эмбрионы живые. Вскрытие эмбрионов: живые эмбрионы, сосуды ХАО без изменений, кожа светлая с единичными мелкоточечными кровоизлияниями, внутренние органы без особенностей, однако на оболочках мозга единичные кровоизлияния. Посевы крови стерильны, а в мазках крови и ликвора обнаружены менингококки.. Из посевов мозга, печени, почек, сердца на сывороточный агар выделены менингококки. Таким образом, у эмбрионов легкая степень поражения органов. Заключение: штамм слабовирулентный. Свежевыделенный штамм менингококка № 1409/131. Овоскопия: жизнеспособность нескольких эмбрионов четко определить не удалось. Вскрытие эмбрионов: погибшие эмбрионы с тромбированными сосудами и капиллярами ХАО, на фоне гиперемированной кожи видна разнокалиберная сыпь, отмечается отек головного мозга, определяемый по выбуханию полушарий мозга и вытеканию красноватожелтой мутной жидкости при прокалывании кожи и оболочек мозга бактериологической петлей, инъекция капилляров и кровоизлияния на оболочках мозга. Выраженные изменения паренхиматозных органов: резкое увеличение в размерах, отек, гиперемия печени и почек. Сердце останавливается в систоле желудочков, предсердия заполнены темной кровью, просвечивающей через гкани сердца. Таким образом, у эмбрирнов средняя степень поражения органов и тканей. Заключение: штамм умеренновирулентныйи Штамм менингококка . 1298. Овосопия: все эмбрионы Погибли. Вскрытие эмбрионов: погибшие эмбрины резко отличаются от контрольных ак по размерам, так и по внешнему иду. Увеличение размеров эмбрионов вязано .с резким отеком тканей, голового мозга и внутренних органов. Кожа езко гиперекирована с цианотичным 7 оттенком, кроме типичной сыпи отмечаются кронойз 1ияния по ходу крупных сосудов на шее и лапах. Типичны спастические сокращения конечностей (по жатые лапы со сведенными пальцами), неподдакяциеся разгибанию-. Поражение эмбрионов тяжелой степени. Заключеиие: высоковирулентный штамм. Вышеизложенным способом удалось установить степень патогенности 39 свежевыделенных штаммов менингококг:ков и уточнить ее у 55 эталонных шта мов нейссерий, из них 30 штаммов мекигококков и 25 штаммов непатогенных вндов нейссерий. Предложенный способ позволяет по шдсить чувствительность и специфичность по сравнению с известным способом, так как позволяет установить жизнеспособность эмбрионов. Кроме того, он в 10 раз экономичнее, поскольку для заражения эмбрионов используют одну дозу вместо десяти. 8 Формула изобретения Способ определения патогенности нейссерий путем заражения куриных эмбрионов с последующим инкубированием и определением жизнеспособности эмбриона, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, эмбрион заражают 2 млрд. микробной взвеси нейссерий по 0,1 мл на хорионаллантоисную оболочку и после инкубирования дополнительно определяют выраженность кровоизлияний, отек мозга и других органов, парезов конечностей, по которым характеризуют степень патогенности. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: 1. Касацкая Л.К. О токсичности и вирулентности менингококковых культур. Канд. дисс. 1975, с.143.